《Talanta》：Development of a cELISA based on a trivalent nanobody–HRP fusion protein targeting BP26 for brucellosis diagnosis
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布鲁氏杆菌BP26蛋白纳米抗体-酶联免疫吸附试验（cELISA）的开发及诊断性能验证。采用三价纳米抗体-过氧化氢酶融合蛋白（3Nbs-HRP）构建新型cELISA检测方法，灵敏度达99%，特异性95.9%，与血清凝集试验和商用ELISA高度一致，为低成本高特异性的布鲁氏病诊断提供新方案。
吴东高|卢青|尹淑荣|史勇|卜轩|翟云义|刘晓芳|杨远豪|张璐|周东|金亚萍|王爱华
西北农林大学兽医学院，中国杨凌712100
摘要
布鲁氏菌病是一种人畜共患病，对人类和动物都构成严重威胁，不仅带来重大的公共卫生风险，还会造成相当大的经济损失。及时准确的诊断对于布鲁氏菌病的有效预防和控制至关重要。然而，目前的ELISA检测方法针对的是脂多糖（LPS），常常与其他革兰氏阴性细菌发生交叉反应，导致特异性较低。此外，高昂的成本限制了其大规模应用和常规实验室筛查的普及。本研究开发了一种针对布鲁氏菌BP26蛋白的cELISA检测方法，使用了一种三价纳米体-辣根过氧化物酶融合蛋白（3Nbs-HRP）。该检测方法表现出优异的性能，灵敏度为99%，特异性为95.9%，重复性高，并且与血清凝集试验（SAT）和商业ELISA检测结果高度一致。综上所述，这种检测方法是一种高效且经济可行的血清学方法，适用于常规诊断实验室的临床筛查，有望提升布鲁氏菌病的监测和控制效果。
引言
布鲁氏菌病是全球最常见的动物源性疾病之一[1]。它由布鲁氏菌引起，这种革兰氏阴性细菌能够在吞噬细胞和非吞噬细胞中存活和繁殖[2]。人类通常通过吸入气溶胶、直接接触受感染的动物或食用未经巴氏杀菌的乳制品和未煮熟的肉类而感染布鲁氏菌[3]。该疾病在人类和动物中都可能导致严重后果，包括流产以及心内膜炎、关节炎、脑膜炎和骨髓炎等疾病[4],[5],[6]。布鲁氏菌病对人类健康和畜牧业生产构成严重威胁，导致全球范围内的重大经济损失。
准确的诊断方法是控制布鲁氏菌病的关键。布鲁氏菌病的诊断方法包括细菌分离培养、血清学检测和分子检测技术[7]。广泛使用的血清学诊断方法主要依赖于LPS抗原[8]，但这可能导致与其他革兰氏阴性细菌的交叉反应，从而产生假阳性结果[9]。此外，商业ELISA试剂盒的高成本也限制了其广泛应用。因此，寻找新的检测靶点并开发更具特异性和成本效益的方法至关重要。多项研究表明，外膜蛋白（OMPs）可以作为布鲁氏菌在人类、山羊和牛中的高精度诊断抗原[10]。其中，BP26蛋白在所有布鲁氏菌物种中高度保守，相比LPS和罗丝 Bengal 平板凝集抗原具有更高的诊断特异性[11]。此外，BP26蛋白在布鲁氏菌感染期间能诱导强烈的持久抗体反应[12],[13]。研究显示，患者血清中的BP26特异性抗体比LPS特异性抗体持续时间更长，甚至在感染后395天仍可检测到[14]。这种强大而持久的抗体反应凸显了BP26作为血清学诊断靶点的显著优势，使其成为开发新型诊断方法的理想候选者。
纳米体（Nbs）是从骆驼科动物中分离出的重链抗体衍生物[15]，是最小的稳定天然抗原结合片段（12–15 kDa）。纳米体具有高稳定性和亲和力[16]、优异的溶解性[17]、耐极端环境的能力[18]，适合大规模生产。它们能够识别并结合隐蔽的表位（如凹陷和沟槽），从而精确靶向单克隆抗体难以到达的位置[19]。由于纳米体体积小且呈单体结构，非常适合多聚化，这种策略可以提供多重性和多特异性[20]。这种方法增强了结合亲和力[21]，使它们能够同时与多个抗原结合。同时靶向不同表位或病原体的能力，加上较高的稳定性，使得多价纳米体在诊断、治疗和工业应用中具有巨大潜力。在本研究中，使用灵活的肽接头将单价纳米体串联组装成BP26-3Nbs-HRP融合蛋白，作为高灵敏度的探针，用于检测布鲁氏菌BP26抗体。
材料
重组OMP25蛋白、pMECS质粒以及pEGFP-N1-RANbody载体（编码包含人Ig kappa链信号肽、HA标签、密码子优化的HRP和His标签的融合蛋白）均保存在我们的实验室中。商业布鲁氏菌cELISA抗体检测试剂盒（针对光滑脂多糖sLPS）购自LiJian Bio-Tech公司。
实验动物
从内蒙古自治区的一家骆驼农场租用了一只临床健康的2岁雄性双峰骆驼
BP26蛋白的表达与纯化
BP26基因通过PCR扩增，目标片段大小为684 bp（补充图S1）。经过适当的限制性内切酶消化后，将其克隆到pET32a载体中，成功构建了pET32a-BP26质粒。重组BP26蛋白在E. coli BL21(DE3)中表达并纯化。SDS-PAGE结果显示其以可溶性形式表达，预期大小为43 kDa（图1A）。纯化后的BP26蛋白浓度为
讨论
布鲁氏菌病的预防和控制很大程度上依赖于高效可靠的血清学诊断方法。确保诊断准确性的关键因素是选择合适的靶抗原。传统的血清学检测方法（如ELISA）通常使用LPS作为检测目标[8]，但针对LPS容易导致与其他革兰氏阴性细菌的交叉反应，从而降低特异性[23]。为了解决这一限制，本研究开发了针对布鲁氏菌外膜蛋白的
结论
总之，本研究成功构建了一个针对布鲁氏菌外膜蛋白BP26的噬菌体展示文库，并从中筛选出了37种BP26特异性纳米体。基于这些纳米体，通过将多价纳米体与HRP融合，开发了一种新型血清学诊断系统——BP26-3Nb14-cELISA。该系统表现出优异的诊断性能，并与传统血清学检测方法（包括SAT和商业cELISA）高度一致
CRediT作者贡献声明
金亚萍：撰写 – 审稿与编辑。周东：资源提供、数据管理。吴东高：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、数据管理。刘晓芳：资源提供。翟云义：资源提供、实验设计。张璐：资源提供、数据管理。杨远豪：资源提供。尹淑荣：验证、方法学设计。卢青：验证、方法学设计。卜轩：实验设计。史勇：资源提供、实验设计。王爱华：撰写 – 审稿与编辑
利益冲突声明
作者声明没有需要披露的利益冲突。
资金来源
本研究得到了宁夏回族自治区重点研发计划项目[编号2018BBF33001]的支持。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益冲突或个人关系。
致谢
作者感谢宁夏回族自治区科学技术厅在[编号2018BBF33001]项目下的财政支持。
