结合无细胞系统与代谢工程重构氢化叶啉酸合成工具箱：维生素B12前体高效生物合成新策略

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Reconstructing the hydrogenobyrinic acid synthetic toolkit by combining cell-free systems and metabolic engineering

本研究针对维生素B12关键中间体氢化叶啉酸（HBA）合成途径复杂、效率低下的难题，通过整合体内代谢工程与体外多酶催化技术，成功构建了人工HBA操纵子FKLHIGJM。研究人员采用核糖体结合位点优化、同工酶筛选等策略，发现下游CobF/K/L/H酶是决定HBA产量的关键限速步骤。优化后的无细胞合成系统在12小时内实现HBA产量37.01±0.94 μM（32.59±0.83 mg/L），较初始设计提升12.2倍。该研究为复杂天然产物的高效生物合成提供了创新技术平台。

　　

在生命科学的精密化工厂中，维生素B₁₂（钴胺素）堪称最复杂的天然产物之一——其生物合成需要30多步酶促反应，如同一条需要精确协调的现代化生产流水线。而氢化叶啉酸（HBA）作为这条生产线上的关键半成品，不仅是维生素B₁₂生物合成的核心中间体，更是制备各种金属取代衍生物的重要前体。然而，自然界中仅有少数微生物掌握着这套精密的生产技术，且其基因簇排列复杂、调控严密，使得人工重构面临巨大挑战。

目前工业维生素B₁₂生产主要依赖天然菌株发酵，但HBA的专门合成研究却进展缓慢。早期研究虽在20世纪90年代实现了毫克级HBA的无细胞合成，但效率始终难以突破。更棘手的是，HBA合成途径中的九个连续酶促反应存在复杂的反馈抑制和代谢平衡问题，如同一个精密的钟表，任何一个齿轮的卡顿都会影响整体运行效率。

面对这一难题，天津科技大学生物工程学院的研究团队另辟蹊径，将代谢工程的无细胞系统巧妙结合，开展了一场针对HBA合成工具箱的"升级改造"。他们首先对天然HBA合成途径进行深度剖析，然后通过理性设计构建人工操纵子，最终建立了一个高效的无细胞合成平台。这项创新性研究发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》期刊，为复杂天然产物的高效生物合成提供了新范式。

关键技术方法主要包括：通过比较不同微生物来源的Cob酶构建人工操纵子；利用核糖体结合位点（RBS）计算器优化基因表达强度；建立无细胞多酶催化系统进行瓶颈反应筛选；采用正交实验设计优化辅因子再生体系；通过粗提物定量和酶滴定策略确定最佳反应条件。

3.1 设计基础人工HBA合成操纵子

研究人员选取具有好氧途径的天然维生素B₁₂生产菌株——荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）和苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）作为模板，分析其天然HBA操纵子的组成特征。通过将Cob酶编码基因按照催化顺序串联排列，并设计统一的翻译起始速率（约10,000 Au），构建了两个基础人工HBA操纵子。表达测试表明，基于S. meliloti来源的操纵子（H2菌株）表现出更优的HBA合成能力，产量达到0.056±0.004 μM/单位生物量。然而，蛋白质表达分析发现CobK主要形成包涵体，通过密码子优化和GST标签融合策略虽提高了可溶性表达，但由于代谢负担增加，反而降低了HBA产量。

3.2 筛选基础HBA操纵子中的酶促反应瓶颈

为识别途径中的限速步骤，研究人员将HBA操纵子分割为两个模块（上游CobAIGJM和下游CobFKLH），分别在高低拷贝数质粒上表达。结果表明，含有pET28a-A（上游模块高拷贝）的菌株在0.2 mM IPTG诱导下生物量降低61.3±1.4%，说明上游途径的激活会显著消耗代谢中间体，造成较大的代谢负担。通过增强单个cob基因的RBS强度，发现强化CobJ、CobF和CobK表达可使HBA产量提高2.23-2.63倍。同工酶筛选实验进一步证实，增强CobK和CobH活性可促进HBA合成，而CobM的表达需要精细平衡——过量表达反而会抑制产量。

3.3 无细胞系统指导的HBA操纵子调整

为克服体内优化的局限性，研究团队建立了无细胞多酶催化平台。使用H2菌株粗提物（CCE）的反应在12小时内产生3.16±0.14 μM HBA，与体内发酵趋势一致。通过补充表达不同酶组合的CCE，发现下游CobFKLH模块的强化对HBA合成促进作用更显著，使产量提升17.1±3.2%，同时减少70.0±10.8%的尿卟啉原III（Urogen III）积累。单酶补充实验显示，添加CobA、CobF和CobL分别提高HBA产量81.7±9.3%、57.9±4.7%和57.5±16.5%。Taguchi正交设计进一步确定S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、CobF、CobI和CobA是影响HBA合成的最关键因素。

3.4 新型合成工具箱的HBA合成

基于上述发现，研究人员设计了优化的人工操纵子FKLHIGJM，将下游cobFKLH基因置于上游位置以增强转录效率。在无细胞系统中，该操纵子使HBA产量提高2.02倍，发酵实验也证实1.42倍的提升。通过系统优化培养条件、酶浓度和辅因子供应，最终建立的优化系统在12小时内产生37.01±0.94 μM HBA，较初始设计提升12.2倍。值得注意的是，溶解氧实验表明，提高摇床转速（150 rpm至800 rpm）会导致HBA产量下降，可能与CobG酶的铁硫簇对氧敏感或中间体的氧化损失有关。

该研究通过整合体内外策略，成功重构了高效的HBA合成工具箱。优化后的FKLHIGJM操纵子不仅显著提升了HBA产量，其建立的无细胞合成平台更为复杂天然产物的途径优化提供了强大工具。特别值得关注的是，研究发现下游CobFKLH模块的强化是提升HBA合成的关键，这一发现颠覆了传统认知中侧重于上游调控的优化策略。同时，研究揭示的代谢负担主要来源于上游途径对代谢中间体的竞争性消耗，为类似复杂途径的理性设计提供了重要参考。

这项工作的创新性在于将无细胞系统的快速原型验证能力与代谢工程的系统优化相结合，建立了一个高效的"设计-构建-测试"循环。相比传统代谢工程，该策略大大缩短了优化周期，且能更精确地识别途径瓶颈。所达到的37.01 μM HBA产量不仅创造了当前报道的最高水平，更为维生素B₁₂及其衍生物的绿色生物制造奠定了坚实基础。这种双平台策略的可扩展性，使其有望应用于其他复杂天然产物的合成生物学研究，推动绿色生物制造的发展。