《Veterinary Microbiology》：Development of an Inactivated H9N2 Subtype Avian Influenza Serological DIVA Vaccine Using the Chimeric A/B NA Epitope Approach
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H9亚型禽流感DIVA疫苗研发成功，通过反向遗传学替换病毒神经氨酸酶基因实现感染与疫苗接种的血清学区分。该重组毒株Re-H9-DIVA-J2在SPF鸡中诱导出10log2以上HI抗体，临床保护率达90%，且不与野毒株交叉反应。研究为禽流感防控提供了新工具，解决了传统疫苗无法区分感染与免疫的问题。
Jingfeng Zhang|Zhiyu Fan|Qunxing Pan|Fei Yu|Huawei Sun|Minhua Sun|Jinping Fu|Jiasheng Song
江苏省农业科学院兽医医学研究所兽医生物工程与技术重点实验室，南京，中国
摘要
疫苗接种是控制H9N2禽流感的关键策略，该亚型对家禽健康和公共安全具有重大影响。目前的疫苗难以区分自然感染动物和接种疫苗的动物，这使得疾病监测和根除工作变得复杂。在这里，我们利用反向遗传学技术开发了一种新型的H9亚型区分感染动物与接种疫苗动物（DIVA）疫苗。重组病毒Re-H9-DIVA-J2是通过将临床分离的H9株（A/chicken/Guangdong/J2/2016）的神经氨酸酶（NA）基因替换为B/Yamagata谱系流感病毒（B/Massachusetts/2012）的NA外域蛋白，并保留H1N1 PR8株的六个内部基因而构建的。这种嵌合病毒在鸡胚中的致病性较低，生长滴度较高（HA≥8 log2），并且在10次传代后B型NA标记物的遗传稳定性良好。三批灭活疫苗在无特定病原体（SPF）鸡身上进行了测试，显示出强烈的免疫原性，接种21天后血凝抑制（HI）抗体滴度达到10 log2。挑战实验确认了完全的临床保护作用，并减少了病毒排出（保护率超过90%）。重要的是，Re-H9-DIVA-J2疫苗接种鸡的血清在免疫荧光（IFA）和ELISA检测中与A型N2蛋白无交叉反应，这将其与野生型感染或常规H9N2疫苗接种动物的血清区分开来。本研究提供了一种安全、具有免疫原性的H9标记疫苗，适用于DIVA诊断，为H9N2的控制和根除提供了有前景的工具。
章节摘录
引言
流感病毒分为A、B和C三种类型，具有不同的生物学和流行病学特征（Jain等人，2025年）。A型流感病毒（IAVs）最具多样性和影响力，能够感染包括鸟类、猪、牛和人类在内的多种宿主（Martins等人，2025年；Tan等人，2023年；null等人，2021年）。其表面糖蛋白——血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）决定了病毒亚型，并介导关键功能：HA结合宿主细胞受体以实现入侵。
伦理声明
所有动物实验均获得了江苏省农业科学院实验动物伦理委员会的批准（许可证编号IACUC-AE-2024-01-022），该委员会根据中国国家标准审查实验方案。本研究中实验室动物的护理和使用遵循美国国立卫生研究院制定的《实验动物护理和使用指南》，以确保符合国际公认的福利标准。
嵌合病毒Re-H9-DIVA-J2的生成
为了生成适用于DIVA检测的H9N2疫苗候选株，我们采用了八质粒反向遗传系统（Hoffmann等人，2002年；Lee等人，2019年）。分离出的GD/J2/2016流感株的HA基因被扩增并测序。系统发育分析证实，该HA基因属于2018-2022年间在中国流行的H9禽流感病毒的同一分支（h9.4.2.5），序列同源性超过91.3%（图1）。嵌合NA基因也被合成出来。
讨论
H9N2禽流感的全球持续存在凸显了需要开发既能有效控制疾病又能准确监测的疫苗的迫切需求，而传统的灭活疫苗未能解决这一挑战（Carnaccini和Perez，2020年；Dong等人，2022年）。我们开发的Re-H9-DIVA-J2疫苗通过引入B/Yamagata谱系的NA外域蛋白，为这一持续存在的问题提供了新的解决方案。这种方法在现有DIVA策略的基础上进行了改进。
未引用的参考文献
Zeng等人，（2023年）；Wu等人，（2022年）
资助
本工作得到了江苏省农业科学技术创新基金（项目编号CX(24)3002）、江苏省农业科学院科研基金项目（KYJJ(25)0704）以及南京海外研究人员科技创新资助项目（025083501230360）的支持。
作者贡献声明
Jiasheng Song：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理、研究设计、资金获取、数据分析、概念构思。Huawei Sun：撰写——审稿与编辑、方法学设计。Fei Yu：撰写——审稿与编辑、方法学设计。Jinping Fu：撰写——审稿与编辑、监督、研究设计、资金获取、数据分析。Minhua Sun：撰写——审稿与编辑、监督、研究设计、数据分析。Jingfeng Zhang：撰写——利益冲突声明
作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
