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这篇综述系统阐述了如何利用脑类器官和类原肠胚模型，在体外重现人类中枢神经系统（CNS）发育过程中关键组织者（如ANR、CH、ZLI、MHB等）的信号活动。文章重点探讨了通过应用形态发生素（如WNTs、FGFs、SHH、BMPs、RA）梯度、合成组织者及微流控等技术，模拟体内前后轴（A/P）和背腹轴（D/V）模式形成，以生成具有区域特异性细胞类型和空间组织的神经组织，为研究人类大脑发育和疾病提供了强大平台。
利用类器官和类原肠胚模型模拟人类中枢神经系统发育中的组织者信号
引言
人类大脑的复杂性源于发育过程中精密的模式形成和形态发生事件。这些过程由被称为“组织者”的特化信号中心引导，它们通过分泌形态发生素来建立浓度梯度，从而指定细胞命运并协调组织架构。理解这些事件对于揭示神经发育障碍的病因至关重要。近年来，人类多能干细胞（hPSCs）衍生的三维（3D）模型，如脑类器官和类原肠胚，已成为在体外重现人类中枢神经系统（CNS）发育的强大工具。本综述探讨了如何利用这些模型来模拟关键的组织者信号，从而生成具有区域特异性身份和复杂性的神经组织。
区域性脑类器官的图案化
从端脑到脊髓，人类中枢神经系统的图案化由一系列组织者驱动。例如，前神经脊（ANR）和皮质缘（CH）图案化端脑，而带状限制丘脑内区（ZLI）图案化间脑，中脑后脑边界（MHB）则塑造中脑和菱脑。早期“非引导”的类器官方案利用了神经前体细胞获得前脑身份的默认倾向，在无需外源图案化分子的情况下，通过自我组织能力再现了皮质等区域的细胞命运规范和形态发生。然而，这种方法产生的后脑身份比例在数量和质量上均存在差异，限制了其可重复性。
为了更一致地指定特定区域身份，研究人员借鉴发育生物学原理，在神经诱导（通常使用双SMAD抑制dSMADi）后，施加特定的形态发生素信号。例如，激活SHH信号可将端脑类器官导向腹侧身份，如形成富含中间神经元的神经节隆起（GE）。类似地，组合WNT抑制和TGF-β抑制有助于稳定皮质身份。对于海马体等内侧命运的生成，则需要模拟CH的活动，通过施加CHIR99021（WNT激动剂）和BMP4的脉冲，诱导表达LEF1和ZBTB20的连续神经上皮形成，这些是海马体能力的驱动因子。
对于中脑后脑区域，MHB作为关键组织者，其功能依赖于WNT和FGF信号的协同作用。在体外，通过联合激活WNT（使用CHIR99021）、FGF（如FGF2或FGF8）和SHH信号，可以引导hPSCs形成中脑样类器官，这些类器官包含多巴胺能（DA）神经元祖细胞，并显示出体内样的空间组织，具有增殖祖细胞、腹侧迁移神经元和分层排列的成熟神经元。这些DA神经元甚至发展出可见的神经黑色素沉积和功能性电生理特性。小脑的发育同样依赖于MHB的信号，特别是较高水平的FGF信号。应用FGF2或FGF8，并结合WNT信号激活（CHIR99021），可诱导小脑身份，产生浦肯野细胞（PCs）和颗粒细胞（GCs）祖细胞等主要细胞类型。
脊髓的发育与体节的发育紧密相连，并由尾芽协调。脊髓类器官方案通常先在聚集前通过激活WNT信号进行后部化，随后使用RA和SHH激动剂（如嘌呤吗啡胺）促进神经管规范和运动神经元等腹侧脊髓身份的指定。一些方案还能诱导形成具有单一管腔的轴向延伸结构，并表达前后Hox基因，再现脊髓的A/P图案化。
再现体外信号梯度
尽管应用固定浓度的形态发生素可以可靠地偏向特定分化命运，但这种方法往往以牺牲细胞多样性为代价，并且无法再现体内关键的信号梯度。为了克服这一限制，新兴技术被用于在类器官内创建更生理相关的形态发生素梯度。
一种策略是使用“合成组织者”。例如，通过将可诱导表达SHH或BMP4的细胞群嵌入到类器官的一端，可以在组织内建立信号梯度。光遗传学系统提供了另一种精妙的控制手段。通过使用分裂Cre重组酶系统，仅在光照刺激下于类器官的特定区域诱导形态发生素（如SHH或BMP4）的表达，可以重现这些信号靶基因（如腹侧标志物FOXA2、OLIG2或背侧标志物MSX1）的梯度表达模式。
微流控设备与微图案化技术相结合，能够产生高度可控的形态发生素梯度。例如，在微流控通道内沿干细胞单层施加WNT激动剂（CHIR99021）的浓度梯度，可以成功诱导出类似于神经管的A/P图案化，一端表达前脑标志物OTX2，另一端表达后脑标志物GBX2，甚至在两者的界面处出现内源性FGF8和WNT1的表达，模拟了MHB组织者。
这些方法表明，在类器官培养中再现空间和时间的信号模式，而不仅仅是均匀的信号激活，对于实现更忠实的体内样组织结构和细胞多样性至关重要。
整合的中枢神经系统图案化：类器官组装体与类原肠胚
虽然区域特异性类器官在模拟特定脑区方面取得了成功，但大脑区域在发育上是相互联系和协调的。为了模拟这种复杂性，研究人员开发了类器官组装体，将不同区域的特异性类器官融合在一起，允许它们相互作用。
一个典型的例子是皮质-GE组装体，它重现了中间神经元从腹侧端脑到背侧皮质的定向迁移过程。这种模型已被用于模拟如Timothy综合征等神经发育障碍中的中间神经元迁移缺陷。更复杂的组装体，如将体感、脊髓、丘脑和皮质类器官整合在一起的“人类上行体感通路组装体”，可以模拟从外周感觉输入到皮质处理的完整神经通路。
类原肠胚代表了另一种更整体的方法，旨在模拟早期胚胎发生和身体计划的确立。通过用WNT激动剂（如CHIR99021）处理hPSC聚集体，可以诱导其沿A/P轴伸长，并形成包含三胚层衍生物的结构。更先进的方案可以产生躯干样结构（TLSs）或伸长多谱系组织类原肠胚（EMLO gastruloids），这些结构包含神经管样结构、成对体节，有时还有内胚层衍生结构，再现了神经管、体节和内脏共发育的方面。
最近，通过将缺氧预处理细胞与常氧培养细胞融合形成的缺氧前后类原肠胚（HAP-gastruloids），甚至能够产生包含OTX2+前脑样组织的更完整结构，这是传统类原肠胚模型通常缺乏的特征。
这些整合模型的价值在于它们能够捕捉不同脑区或组织类型之间的相互作用，例如皮质脊髓肌肉回路中的相互作用，或神经管与体节之间的协同形态发生，这对于全面理解神经系统发育和疾病机制至关重要。
展望与未来方向
在体外重现人类神经发育的努力已经取得了显著进展。当前模型在再现特定细胞状态转录组方面尤为成功。然而，在组织尺度形态发生的保真度方面，尤其是在后脑和脊髓区域，仍然存在差距。
未来的方向包括进一步整合指导性与自组织原则。虽然强烈的外源引导可以提高可重复性，但可能会限制形态发生的复杂性。相反，促进组织者样梯度形成的方法则能增强神经多样性和空间图案化。将光遗传学、合成组织者和微流控等梯度生成技术与可扩展、灌注式长期培养系统相结合，将是维持长期活力和功能成熟的关键。
另一个重要挑战是如何在类器官和类原肠胚中重现前神经组织。这可能需要模拟胚胎中保护前上皮细胞免受后部化信号影响的机制，例如小鼠中的前内脏内胚层（AVE）的作用。理解并模拟这些保护机制将为在体外产生包含前脑和后脑结构的更完整的中枢神经系统模型铺平道路。
最后，细胞外基质支架、血管化共培养系统以及融入胚胎外组织（如滋养层干细胞）等培养环境的优化，将有助于改善营养输送、减少坏死，并支持更复杂的组织-组织相互作用，从而提升模型的生理相关性和寿命。
总之，通过交叉应用指导性分化、自组织原理、工程化梯度控制和整合组装策略，类器官和类原肠胚模型有望越来越逼真地模拟人类中枢神经系统的模式形成和形态发生，为人类大脑发育、进化
