《Journal of Inflammation Research》：Two-Dimensional PCR for Simultaneous Detection of Fecal Bacterial Markers in the Diagnosis and Management of Inflammatory Bowel Disease
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本综述系统阐述了基于碱基淬灭探针技术的二维PCR（2D-PCR）方法在炎症性肠病（IBD）诊断与管理中的突破性应用。该方法通过单管闭管同步检测四种IBD相关微生物（Ruminococcus gnavus、Veillonella spp.、Ruminococcus torques和Clostridioides difficile），展现10 copies/μL的高灵敏度与零交叉反应特性。结合粪便隐血试验（FOBT）的联合诊断模型显著提升IBD鉴别效能（AUC=0.9224），其中R. torques作为克罗恩病（CD）特异性标志物（8.33%阳性率），C. difficile检测指导抗生素精准治疗。该技术以低成本、低仪器需求优势，为IBD无创诊断和个体化治疗提供新策略。
Abstract
炎症性肠病（IBD）在中国发病率持续上升，其患者存在肠道菌群失调，检测IBD相关肠道微生物有助于诊断和管理。研究开发基于碱基淬灭探针技术的二维PCR（2D-PCR）方法，实现单管闭管同步检测四种IBD相关微生物：Ruminococcus gnavus、Veillonella spp.、Ruminococcus torques和Clostridioides difficile。临床粪便样本测试涵盖224例IBD患者、112例其他消化系统疾病患者和57例健康对照。2D-PCR方法检测限达10 copies/μL，引物间无交叉反应。R. gnavus和Veillonella spp.结合粪便隐血试验（FOBT）可区分IBD患者与健康对照（AUC=0.9224）及与其他消化系统疾病（AUC=0.7984）。R. torques仅在克罗恩病（CD）患者中检出（阳性率8.33%），提示其作为特异性诊断标志物的潜力。C. difficile在IBD患者中检出率8.93%，其检测可指导抗生素治疗。2D-PCR方法成本低且适合广泛临床应用，这些微生物标志物有助于IBD诊断、鉴别诊断和治疗指导。
Introduction
炎症性肠病（IBD）是一种慢性非特异性胃肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。IBD诊断缺乏金标准，主要依赖临床表现、内镜和病理检查，但结肠镜检查具侵入性且不适合重复评估。IBD发病涉及免疫失调、遗传易感性、微生物因素和环境触发因素相互作用，患者多存在肠道菌群失调。粪便微生物可非侵入性反映肠道菌群组成，成为有前景的IBD无创生物标志物。通过GMrepo数据库分析，发现Ruminococcus gnavus、Clostridioides difficile和Veillonella属在IBD患者中丰度升高，Ruminococcus torques在CD中增加而在UC中减少。现有微生物检测方法如培养法、16S rRNA测序和宏基因组测序各有局限。二维PCR（2D-PCR）结合碱基淬灭探针技术和熔解曲线分析，通过设计标签序列产生不同熔解温度（Tm）实现多重检测，具操作简单、成本低、仪器要求低等优势。本研究通过重新设计标签和引物序列，构建同步检测R. gnavus、Veillonella spp.、C. difficile和R. torques的2D-PCR方法，评估其在IBD诊断、分型和治疗指导中的潜力。
Materials and Methods
使用FAM探针（5′-FAM-CCATTACCAACCTTATACACTTCCAC-P-3′）进行信号检测。标签通过改变探针序列部分碱基设计，添加到正向引物5′端，使各引物产物Tm不同。从NCBI检索C. difficile、R. gnavus、Veillonella spp.和R. torques的16S rRNA序列设计引物，并设计基于细菌共享保守序列的内参引物（16S rRNA）。2D-PCR体系体积25 μL，包含10×PCR缓冲液（无Mg2+）、MgCl2、dNTPs、热启动Taq DNA聚合酶、FAM探针、标签正向引物、反向引物、DNA模板和去离子水。扩增程序：95°C 10分钟；95°C 10秒、60°C 40秒，40循环；95°C 1分钟；30°C至80°C升温，每0.5°C停留4秒检测荧光；40°C 30秒。熔解曲线分析中特定Tm处出现峰值判为阳性。
性能验证中，将各目标引物序列连接到pUC57载体构建质粒，稀释为108至10 copies/μL浓度梯度验证检测限，使用105copies/μL质粒验证引物交叉反应。临床样本来自2023年1月至2024年12月上海中医药大学附属龙华医院确诊的IBD患者（经内镜和病理诊断）、其他消化系统疾病患者（结直肠癌、肛瘘、结肠息肉等）和健康对照。粪便样本经视觉质控后-80°C保存（最长6个月），使用天根粪便DNA提取试剂盒提取DNA，严格防污染。统计分析使用SPSS 25、GraphPad Prism 7.0和R 4.4.3软件，通过二元逻辑回归分析构建诊断模型，ROC曲线和AUC评估诊断效能，Kappa一致性检验和K折交叉验证验证方法可靠性。
Results
Construction of 2D-PCR Method
单引物体系熔解曲线显示，16S rRNA、C. difficile、R. gnavus、Veillonella spp.和R. torques的Tm分别为43°C、47°C、52°C、58°C和63°C，完全分离。交叉反应验证确认各引物仅与对应质粒反应无交叉。检测限验证显示R. gnavus、Veillonella spp.、R. torques、C. difficile和内参的最低检测浓度分别为100、10、1000、10和10 copies/μL。混合体系（五质粒各105copies/μL）可同步检测四目标微生物和内参，Tm分别为41°C、46°C、51°C、58°C和63°C，略低于单体系。
Characteristics of Patients
训练队列包含114例IBD患者（60例CD、54例UC）、29例对照和55例其他消化系统疾病患者；验证队列包含110例IBD患者（60例CD、50例UC）、28例对照和57例其他消化系统疾病患者。收集性别、年龄、C反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）、粪便钙卫蛋白（FC）和粪便隐血试验（FOBT）等临床生化参数用于诊断模型构建。
Detection of Clinical Samples
粪便DNA提取后使用2D-PCR混合体系检测，双重复实验显示批内一致率100%，批间一致性Kappa值分别为C. difficile 0.882、R. gnavus 0.903、Veillonella spp. 0.787、R. torques 0.773。仅内参阳性样本纳入分析。训练队列中IBD患者C. difficile、R. gnavus、Veillonella spp.和R. torques阳性率分别为9.6%、56.1%、39.4%和3.5%（仅CD）；验证队列中分别为8.2%、59.1%、41.8%和5.5%（仅CD）。因C. difficile和R. torques阳性率<10%，排除出诊断模型。R. gnavus和Veillonella spp.在IBD患者中阳性率均高于对照组（训练队列31%和6.9%；验证队列35.7%和10.7%）和其他消化系统疾病组（训练队列43.6%和21.8%；验证队列29.8%和19.3%），用于诊断模型构建。
Construction of Diagnostic Model to Differentiate IBD from Control Group
R. gnavus+Veillonella spp.模型区分IBD与对照的AUC在训练队列为0.7129，验证队列为0.7076。结合FOBT后，训练队列AUC提升至0.8719，验证队列提升至0.9224（敏感性85.11%，特异性92.59%）。结合CRP和ESR后诊断效能未显著提升。K折交叉验证显示R. gnavus+Veillonella spp.+FOBT模型准确度0.8318（Kappa值0.5002），校准曲线验证预测准确性高（平均绝对误差0.034）。
Construction of Diagnostic Model to Differentiate IBD from Other Digestive Diseases
R. gnavus+Veillonella spp.模型区分IBD与其他消化系统疾病的AUC在训练队列为0.61，验证队列为0.6864。结合FOBT后，训练队列AUC提升至0.7164，验证队列提升至0.7984（敏感性66.67%，特异性84.95%）。结合CRP未显著增强效能。K折交叉验证准确度0.7346（Kappa值0.3420），校准曲线验证预测准确性高（平均绝对误差0.022）。
Application of R. torques in CD Diagnosis
R. torques在训练和验证队列IBD患者中总阳性率4.91%（10/224），仅见于CD患者（10/120，8.33%），对照组和其他消化系统疾病组均为阴性。R. torques+FOBT+ESR模型区分CD与UC的AUC在训练队列为0.7503，验证队列为0.6957，可作为IBD亚型鉴别模型。
Treatment Strategy Based on C. difficile Detection
IBD患者C. difficile阳性率8.93%（20/224）。9例可用病历中，2例接受抗生素（拉氧头孢、那拉星、亚胺培南或舒普深），3例使用免疫抑制剂（乌司奴单抗、维多珠单抗或乌帕替尼），这些是CDI（艰难梭菌感染）危险因素。4例曾行培养鉴定法C. difficile检测，仅1例阳性。1例具典型CDI症状和肠道假膜，但培养鉴定结果阴性，可能延误治疗。2D-PCR提高CDI检出率可优化IBD管理，包括万古霉素或非达霉素应用及生物制剂调整。
Discussion
肠道菌群失调通过破坏肠屏障、激活免疫和维持慢性炎症在IBD发病和进展中起重要作用。2D-PCR方法较16S rRNA测序和宏基因组测序更准确、经济，具结果直观、技术要求低等优势。R. gnavus和Veillonella spp.结合FOBT的IBD诊断模型效能显著，R. torques结合FOBT和ESR的CD特异性诊断模型效能一般（AUC 0.75和0.70），部分因R. torques阳性率低且检测限较差（1000 copies/μL），需通过引物重设计或提高模板量优化。C. difficile检测助力IBD-CDI诊断治疗，IBD是CDI独立危险因素，免疫抑制剂和抗生素增加风险，2D-PCR提高检出率可指导治疗。部分粪便样本因DNA提取失败排除，样本质量是关键因素，需优化标准化采样保存流程。粪便生物标志物在IBD诊断管理中应用不足，标准化Protocol是临床推广关键。
Conclusion
2D-PCR方法实现单管闭管同步检测R. gnavus、Veillonella spp.、R. torques和C. difficile，操作简便、成本低，适合IBD管理重复监测。虽存在R. torques检测灵敏度不足等局限，但这些粪便标志物作为常规生物标志物补充，助力IBD诊断和治疗。未来可扩展微生物面板，需多中心临床验证其临床意义。
Abbreviations
IBD（炎症性肠病）；UC（溃疡性结肠炎）；CD（克罗恩病）；CDI（艰难梭菌感染）；PCR（聚合酶链反应）；2D-PCR（二维PCR）；Tm（熔解温度）；NCBI（美国国家生物技术信息中心）；AUC（ROC曲线下面积）；CRP（C反应蛋白）；ESR（血沉）；FC（粪便钙卫蛋白）；FOBT（粪便隐血试验）；CI（置信区间）；PPV（阳性预测值）；NPV（阴性预测值）。
