《mAbs》：Alpseq: an open-source workflow to turbocharge nanobody discovery with high-throughput sequencing
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本刊推荐：该研究开发了开源软件Alpseq，通过无PCR建库流程和Nextflow并行计算，实现纳米抗体（VHH）高通量测序（NGS）数据的自动化分析。其交互式报告功能可直观展示CDR3聚类与富集情况（log2FC），为跨抗原结合候选分子的筛选提供新范式。
摘要概述
纳米抗体作为单域抗体（VHH），因其小尺寸、高稳定性和优异结合特异性已成为生物技术领域的重要工具。尽管二代测序（NGS）技术能够深度分析大型纳米抗体文库和淘选实验，但海量数据的处理仍存在生物信息学挑战。Alpseq工作流程应运而生，其包含优化的无PCR建库方案和开源分析流程，通过Nextflow实现原始测序数据的一键式预处理，并整合质量控、多样性分析、富集序列识别等功能模块。该平台支持多轮淘选实验的复杂设计，可自动生成交互式报告，显著降低纳米抗体发现领域的NGS技术应用门槛。
纳米抗体的生物学特性与应用前景
纳米抗体源自骆驼科动物（如羊驼、大羊驼）及部分软骨鱼类的天然重链抗体（HcAb）可变区。其约400 bp的短序列长度使其能够通过2×300 bp双端测序实现全长覆盖，较传统抗体（>800 bp）更具NGS技术适配性。纳米抗体凭借对隐蔽表位的识别能力、组织穿透性及血脑屏障通过性，在诊断试剂开发和临床治疗领域展现出独特优势。目前主要通过噬菌体展示、酵母展示等体外展示技术从免疫/天然/合成文库中筛选特异性纳米抗体，而生物淘选过程中的富集效果评估长期依赖低通量的Sanger测序，仅能捕获数百个克隆，难以全面反映文库多样性。
NGS技术在纳米抗体发现中的瓶颈
虽然NGS技术能够捕获数万个独特克隆，但当前领域存在两大技术壁垒：建库阶段PCR扩增引入的偏好性需通过分子标识符（UMI）进行校正，而无PCR策略可直接消除该偏差；另一方面，缺乏专为纳米抗体设计的开源分析工具，现有商业软件成本高昂且灵活性不足。尽管部分抗体分析流程可兼容纳米抗体数据，但多数工具需同时处理重轻链，或仅适用于免疫组库数据而非体外淘选数据。
Alpseq工作流程的技术创新
实验室建库方案优化
Alpseq通过三组限制性内切酶组合切割纳米抗体质粒文库，经凝胶提取和磁珠纯化后直接连接测序接头，建立无PCR扩增的Illumina文库制备方案。在NextSeq 2000平台P1试剂盒（2×300 cycles）运行中平均产生7500万条全长序列，较MiSeq平台数据量提升7.5倍，且读长末端质量显著改善。
高效生物信息学分析流程
预处理模块采用Nextflow工作流语言实现多样本并行处理，通过TrimGalore去接头、FLASH序列拼接后，创新性引入matchbox软件进行纳米抗体注释。相比金标准IgBLAST，matchbox将注释速度提升2-5倍，且保持97.85%的基因注释一致性。该模块还集成FastQC质量评估，自动生成包含测序质量、合并效率等指标的综合质控报告。
智能化数据分析与可视化
分析模块以CDR3为克隆识别单元，通过log2折叠变化（logFC）计算公式：log2[(终轮CPM+10)/(初始轮CPM+10)]量化富集程度。采用CD-HIT对氨基酸序列进行聚类（默认80%相似度阈值），剔除终轮CPM<100的假阳性簇。通过BLOSUM62矩阵进行多序列比对，结合irlba算法生成多维尺度（MDS）图，直观展示可能结合相同表位的"超簇"结构。
复杂实验设计的支持能力
该平台支持多重复实验的交叉验证，通过散点图矩阵比较不同重复间纳米抗体标准化丰度（CPM）分布。针对多抗原比较实验，采用UpSet图可视化交叉反应簇的重叠情况，并可实现靶标特异性序列的减法筛选。在公开数据集验证中，12分钟内完成Hanke等人数据的全流程分析，成功识别出已报道的Ty1克隆及300个相关序列簇。
实际应用与拓展潜力
Alpseq已成功处理数百个内部数据集，其R语言软件包允许用户自定义富集阈值、聚类参数等分析条件。预处理模块兼容Sanger测序数据和长读长测序平台，输出结果可直接用于机器学习模型训练，预测纳米抗体的可开发性、空间结构及结合残基。该开源策略有助于推动领域内数据共享文化的发展，为人工智能辅助的抗体设计奠定基础。
方法论精要
实验采用NEBNext多重 oligo 系统构建PCR-free文库，经0.7×AMPure XP磁珠筛选后，通过KAPA文库定量试剂盒准确定量。测序时加入20% PhiX对照，确保2色化学测序的碱基平衡。生物信息学分析中，matchbox首先随机抽样1000条序列识别前15个V基因，通过30%容错率匹配FRW4与保守半胱氨酸区间，精准界定CDR3区域。富集克隆筛选采用"终轮CPM>1000且logFC>2.5"的双阈值策略，优先从符合条件的簇中选择最丰富代表序列组成Top100候选名单。
结论与展望
Alpseq通过整合实验建库、计算分析和可视化报告，建立了纳米抗体NGS研究的标准化框架。其开源特性不仅降低了技术使用门槛，更通过模块化设计支持个性化分析需求。该工作流程有望成为纳米抗体发现领域的基础工具，推动高通量筛选与人工智能预测模型的深度融合。
