《Cell Reports Methods》：Using DIPA-CRISPR for simple and efficient endogenous protein tagging in insects
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本研究针对蟑螂等卵鞘型昆虫无法通过卵显微注射实现大片段报告基因精准敲入的技术瓶颈，开发了基于DIPA-CRISPR与同源定向修复（HDR）的融合蛋白标记策略。通过在德国小蠊Blattella germanica的distal-less（dll）基因位点精准插入mCherry荧光蛋白，首次实现了活体胚胎中内源蛋白定位、丰度与动态的实时可视化，为半变态昆虫的功能基因组学研究提供了关键技术支撑。
在昆虫生物学研究领域，精准追踪内源蛋白的时空动态是解析基因功能的关键。然而，对于蟑螂这类卵鞘型昆虫，其卵块（卵鞘）被坚硬外壳包裹，无法进行常规显微注射，导致大片段荧光报告基因的敲入始终是技术难点。德国小蠊Blattella germanica作为半变态昆虫的代表物种，其胚胎发育过程与人类疾病模型、害虫防控研究密切相关，却因技术限制长期缺乏高效的蛋白标记工具。
为突破这一瓶颈，研究人员将目光投向DIPA-CRISPR（直接亲本CRISPR）技术。该技术通过向成年雌虫腹部直接注射CRISPR组分，可绕过卵鞘屏障实现对生殖细胞基因编辑。然而，能否利用DIPA-CRISPR介导同源定向修复（HDR），实现荧光蛋白的精准敲入仍属未知。本研究创新性地将DIPA-CRISPR与HDR模板结合，以distal-less（dll）基因——一个在肢体和神经系统发育中起核心作用的转录因子——为靶点，尝试在活体蟑螂胚胎中实现mCherry荧光蛋白的内源标记。
关键技术方法包括：设计靶向dll基因终止密码子附近的sgRNA；构建含长/短同源臂的mCherry供体模板（质粒与线性双链DNA）；通过DIPA-CRISPR向成年雌虫注射Cas9核糖核蛋白复合物与供体；利用荧光显微镜观察胚胎蛋白定位，并通过PCR与测序验证基因整合。实验所用蟑螂样本来自实验室长期繁育的德国小蠊品系。
设计并验证靶向dll基因的CRISPR组件
研究人员首先在dll基因编码区末端设计了两条sgRNA（sgRNA1与sgRNA2），其切割位点紧邻终止密码子，以确保蛋白功能不受破坏。体外消化实验证实二者均能高效切割目标DNA片段。通过向雌虫注射Cas9与sgRNA复合物，发现69个胚胎均发育正常，且T7内切酶检测到靶位点突变，证明sgRNA在活体内具有编辑活性且无毒性。
基于DIPA-CRISPR的高效敲入策略
研究团队构建了两种HDR供体：含800 bp长同源臂的质粒供体，以及仅含30 bp短同源臂的线性双链DNA供体。将Cas9、sgRNA与供体混合后注射至雌虫体内，在13个卵鞘中有4个检测到mCherry荧光信号，表明敲入成功。对照实验（无Cas9组）无荧光产生，排除非特异性整合。通过PCR扩增mCherry序列及插入位点侧翼区域，在G1代胚胎和若虫中均验证到精准整合，且测序显示插入框位正确。
Dll::mCherry融合蛋白的胚胎空间分布
在4日龄活体胚胎中，Dll::mCherry蛋白呈现明显组织特异性：荧光信号富集于附肢（如触角、腿节）远端尖端，与已知dll转录本分布一致；同时在中枢神经系统（如腹神经索）出现意外强信号，提示Dll在蟑螂神经发育中可能具有进化保守功能。这一发现首次实现无需抗体即可直观观察内源蛋白的动态分布。
研究结论与意义
本研究成功建立了一套适用于卵鞘型昆虫的荧光标记技术体系，证实DIPA-CRISPR与HDR联用可实现内源蛋白的可遗传标记。尽管G0代胚胎为嵌合体且荧光检测需牺牲样本，但策略兼具可操作性（无需定制Cas9或特殊递送系统）与灵活性（兼容质粒/线性供体）。该技术不仅为德国小蠊的发育生物学研究提供工具，更可推广至其他难以显微注射的昆虫物种，在害虫基因调控、生态进化研究等领域具有广泛应用前景。论文成果发表于《Cell Reports Methods》，为非模式生物精准基因编辑提供了重要范式。
