《Journal of Hepatocellular Carcinoma》：Integrative Single-Cell and Spatial Transcriptomic Analysis Reveals MAIT Cell Dysfunction in Relapsed HCC
Abstract
Purpose
肝细胞癌（HCC）在根治性治疗后频繁复发，肿瘤免疫微环境在疾病进展中扮演重要角色。然而，黏膜相关恒定T（MAIT）细胞在复发HCC中的作用仍知之甚少。本研究旨在表征复发HCC中MAIT细胞的转录组和空间特征及其与恶性肝细胞表型的关联。
Patients and Methods
使用配对的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学技术分析了来自原发性（n = 3）和复发性（n = 2）HCC患者的肿瘤样本。使用Seurat处理scRNA-seq数据（49,229个细胞），并进行Harmony批次校正和无监督聚类。通过拷贝数变异推断识别恶性肝细胞。对来自35个感兴趣区域（ROI）的空间转录组数据进行了归一化处理，并使用scRNA-seq衍生的参考谱进行去卷积分析。使用公共HCC scRNA-seq数据集进行了独立验证。
Results
整合分析揭示了复发HCC中独特的肿瘤微环境特征。与原发性肿瘤相比，复发肿瘤显示出具有更高癌症干性相关转录特征的恶性肝细胞比例增加（1.18倍，p < 0.0001），空间分析进一步支持其在肿瘤区域的富集（1.10倍，p ≤ 0.05）。在T/NK区室中，MAIT细胞在复发肿瘤区域显著富集（2.71倍，p ≤ 0.05）。转录组分析确定了原发性和复发性HCC之间不同的MAIT细胞状态，复发MAIT细胞表现出功能失调表型。细胞间相互作用分析提示复发肿瘤中MAIT细胞与恶性肝细胞之间的配体-受体相互作用增强。在TCGA LIHC队列中，高复发MAIT细胞特征评分与较差的总生存期相关（HR = 1.52，p ≤ 0.05）。
Conclusion
复发HCC的特征在于肿瘤微环境中恶性肝细胞干性增强和MAIT细胞状态改变。这些发现提示MAIT细胞失调与复发特异性肿瘤生物学之间存在关联，值得进一步的功能研究。
Introduction
肝细胞癌（HCC）占肝癌病例的近80%，是全球第六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因。其高复发率（高达88%）和有限的治疗效果凸显了对更好治疗策略的需求。HCC的侵袭性特性强调需要进行更深入的细胞和分子研究。
肿瘤异质性由多种细胞组成，包括癌细胞、免疫细胞（T细胞、B细胞、巨噬细胞）和非免疫细胞（成纤维细胞和内皮细胞），这些细胞有助于免疫治疗耐药、复发和不良结局。最近的研究强调了HCC肿瘤微环境（TME）中不同疾病阶段免疫亚群的多样性，包括巨噬细胞、树突状细胞、调节性T细胞和CD8+T细胞。然而，许多现有研究集中于原发性肿瘤，微环境差异导致HCC复发的机制仍不清楚。
黏膜相关恒定T（MAIT）细胞是一种MR1限制的先天样T细胞亚群，在健康肝脏中占肝内T细胞的45%。尽管MAIT细胞越来越被认为是组织免疫和炎症的关键调节因子，但它们在HCC进展中的作用仍不明确。先前的研究报道了HCC肿瘤中MAIT细胞浸润增加和功能受损，与不良临床结局相关。相反，其他使用批量转录组数据的分析将较高的MAIT细胞相关基因特征与改善的生存期相关联。这些看似矛盾的观察结果可能反映了MAIT细胞的表型异质性，它们可以根据局部微环境线索采用效应样、功能失调/耗竭或增殖状态。重要的是，肿瘤浸润MAIT细胞通常表现出激活相关功能障碍的特征，包括抑制性受体上调和细胞毒性能力降低，表明其功能状态而非单纯丰度可能至关重要。
尽管对原发性HCC中MAIT细胞的兴趣日益增长，但它们在复发HCC中的分子特征仍然很少被描述。特别是，尚不清楚MAIT细胞是否经历复发特异性转录重编程，这种变化是否在空间上局限于肿瘤区域，以及MAIT细胞如何在复发TME内与肿瘤细胞相互作用。这些问题在生物学上很重要，因为复发HCC是在经过先前治疗和肿瘤进化而重塑的免疫环境中发展的，这可能深刻改变免疫细胞状态和肿瘤-免疫相互作用。因此，从原发性HCC得出的发现不能直接外推到复发性疾病。
空间转录组学通过保存组织结构并能够在定义的肿瘤和邻近非肿瘤区域内分析转录程序，为解决这些未解决的问题提供了独特的机会。然而，迄今为止，针对复发HCC的空间分辨免疫分析，特别是关注MAIT细胞的研究，在很大程度上尚未探索。将空间转录组学与单细胞RNA测序（scRNA-seq）整合，可以实现高分辨率细胞状态识别和免疫-肿瘤相互作用的空间背景化，提供任何单一方法无法实现的见解。
基于这些考虑，我们假设复发HCC的特征在于独特的肿瘤微环境特征，包括复发特异性的MAIT细胞丰度、表型和空间分布变化。为了验证这一假设，我们对来自独立队列的原发性和复发性HCC患者的活检样本进行了整合的scRNA-seq和NanoString GeoMx空间转录组学分析。通过结合单细胞分辨率和空间背景，并在外部公共数据集中验证关键观察结果，本研究旨在定义复发相关的免疫和肿瘤特征，特别关注复发HCC中MAIT细胞失调及其与恶性肝细胞干性的潜在关联。
Materials and Methods
Patient Samples
本研究获得了首尔国立大学盆唐医院机构审查委员会的伦理批准，所有参与者均提供了书面知情同意。所有程序均符合《赫尔辛基宣言》的原则。纳入了在首尔国立大学盆唐医院（2022年3月至2023年11月）诊断为HCC的五名个体。诊断基于韩国肝癌研究组和韩国国家癌症中心HCC管理实践指南中概述的标准。
五名患者中，三名患有原发性HCC，两名患有复发性HCC。一位拥有10年经验的介入放射科医生使用超声检查每个目标病变，以确认其是否适合射频消融。在消融前，同一位放射科医生在实时超声引导下对目标病变进行了3-4次经皮核心针活检穿刺。这些活检使用17号核心活检装置，为每位患者获取了2-3个新鲜肝肿瘤样本（10-12毫米）。在组织收集时，所有患者均未表现出急性肝损伤的临床或生化证据。由于并非所有复发性HCC病例都常规进行活检，特别是在放射学诊断足够的情况下，复发性HCC活检样本的可用性有限，使得这些样本对于整合分子分析特别有价值。
Sample Processing
组织样本在补充了10%胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute 1640培养基中运输。将来自同一患者的肝活检样本的25%部分处理成福尔马林固定石蜡包埋块，用于苏木精和伊红（H&E）染色及空间转录组学分析。组织样本在室温下于4%多聚甲醛溶液中固定24小时，随后进行石蜡包埋。切片厚度为4微米。剩余组织用于scRNA-seq分析。
H&E Staining
使用自动染色机对切片进行H&E染色。脱蜡在二甲苯中进行10分钟，重复四次。脱水在100%乙醇中进行1分钟（两次），95%乙醇中进行1分钟（两次）。然后冲洗并干燥切片。苏木精染色进行7分钟，然后冲洗。切片用1% HCl处理5分钟，冲洗，用伊红染色3秒，然后冲洗。脱水使用95%乙醇进行10秒（两次），然后使用100%乙醇进行10秒（两次）。透明在二甲苯中进行10秒（三次）。最后，使用自动盖玻片机封片，并使用幻灯片扫描仪扫描。
Spatial Transcriptomic Analysis
Tissue Preparation
载玻片在60°C下烘烤30分钟，并进行脱蜡、复水、抗原修复、RNA暴露和后固定处理。将载玻片与RNA探针混合物在杂交室中于37°C孵育过夜。洗涤后，组织在室温下与形态学标记物孵育1小时，包括SYTO 13、Alexa Fluor 647偶联的CD3e、PE偶联的CD34和Alexa Fluor 532偶联的泛细胞角蛋白。
Regions of Interest (ROI) Selection & Collection
将载玻片上传至数字空间分析（DSP）仪器，并根据特定标记物（包括CD3（T细胞）、CD34（肿瘤标记物，以其在HCC血管生成中的作用而闻名）和泛细胞角蛋白（上皮细胞）的荧光信号选择ROI。基于H&E染色观察到的形态学特征和使用免疫荧光（IF）染色显示高CD34表达的区域选择肿瘤区域。选定的ROI暴露于紫外光下，收集光裂解的寡核苷酸，并使用GeoMx软件进行杂交。
Library Preparation & Sequencing
使用GeoMx Seq Code引物板和PCR预混液进行PCR，根据制造商的说明收集、合并和纯化ROI衍生产物。在测序前评估文库质量，并在NovaSeq 6000平台上对文库进行测序。为了尽量减少潜在的技术偏差来源，所有GeoMx实验均由同一操作员使用相同的设备、试剂和方案在所有样本中进行。文库制备严格遵循制造商推荐的工作流程，未进行方案修改，确保样本间的一致性并减少批次相关的技术变异。
Sequencing Data Processing & Analysis
使用GeoMx NGS流程处理FASTQ文件以生成计数矩阵。使用standR包中的addPerROIQC函数进行质量控制（QC）。去除了在超过90%的ROI中低表达（定义为计数<5）的基因。通过排除细胞核数<200的区域应用ROI水平QC。过滤后，使用standR中实现的修剪均值M值（TMM）方法对计数数据进行归一化。使用limma包进行肿瘤和非肿瘤ROI之间的差异表达分析。使用SpatialDecon R库进行细胞类型去卷积，并使用create_profile_matrix函数从我们的scRNA-seq数据集生成自定义表达参考。
Single Cell RNA Sequencing
Cell Isolation
剩余组织用PBS冲洗，并与Liberase一起孵育。将组织切碎，并在37°C下孵育30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。孵育后，将样品移液10次。将细胞悬液通过70微米细胞过滤器过滤，并收集到含有FBS的管中。在4°C下以60g离心1分钟，不刹车。上清液在4°C下以500g离心5分钟。将细胞重悬于CELLBANKER 1中，并在液氮中冷冻保存。
Library Preparation & Sequencing
将冷冻保存的细胞解冻并处理成单细胞悬液。在文库制备前评估细胞活力和细胞计数，所有样本均将40,000个细胞加载到每个凝胶珠乳浊液（GEM）中，以确保一致性并最大限度地减少不同条件之间的技术变异。使用Chromium Next GEM Single Cell 5′ Kit v2按照制造商的说明制备单细胞文库，无偏差。GEM生成后，样品进行GEM后清理和cDNA扩增。评估cDNA质量和浓度，并根据测量的cDNA输入调整PCR扩增循环，以避免扩增偏差。最终文库在测序前进行质量控制，并在NovaSeq 6000平台上进行测序。
Sequencing Data Processing
使用Cell Ranger流程（v 7.1.0）比对读数并生成基因-细胞唯一分子标识符（UMI）矩阵。使用R包SoupX去除环境RNA。使用Seurat（v5.1.0）读取scRNA-seq矩阵。排除在<3个细胞中检测到的特征以及基因数<200或线粒体基因百分比>10%的细胞。使用scDblFinder包（版本1.18）去除双细胞。使用“NormalizeData”函数对基因表达水平进行归一化。使用Harmony（v1.2.4）校正由个体患者和测序运行引起的批次效应。将每个样本视为一个单独的批次。在PCA的前20个主成分上运行Harmony整合，使用默认参数（theta=2，lambda=1）来对齐不同批次的细胞，同时保留生物变异性。
Cell Clustering and Annotation
使用Seurat中的RunPCA函数对scRNA-seq数据进行主成分分析（PCA），并使用前20个PC进行UMAP降维。使用FindNeighbors和FindClusters（采用Louvain算法，分辨率参数为1.2）进行无监督聚类。使用不同的随机种子重复分析，以确保聚类分配的稳健性。手动合并具有高度相似经典标记基因表达谱的聚类，以提高生物学可解释性。基于经典标记基因注释细胞类型，并使用FindAllMarkers（min.pct = 0.25）识别聚类特异性标记基因。使用Scanpy进行UMAP和热图可视化。
Differentially Expressed Genes Analysis
使用Seurat包的FindMarkers函数识别差异表达基因（DEG）。使用调整后p值<0.05和log2倍数变化>0.5进行过滤。使用EnhancedVolcano可视化原发性和复发性肿瘤之间MAIT细胞的DEG。使用R包clusterProfiler分别对DEG进行GO（基因本体论）分析。
Copy Number Variation (CNV) Analysis in scRNA-Seq
使用inferCNV和Copykat R包估计CNV。基于Copykat结果识别恶性细胞。使用髓系细胞、B细胞和TNK细胞作为参考，以10x默认参数运行InferCNV。
Cell-to-Cell Interaction Analysis
为了分析恶性肝细胞和T细胞之间的相互作用，我们使用CellPhoneDB，以归一化计数数据作为输入。使用P值<0.05过滤显著的配体-受体对。
The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database Analysis
使用TCGAbiolinks R包从癌症基因组图谱（TCGA）和UCSC Xena获取肝细胞癌（HCC）队列的基因表达谱和临床信息。基于预定义的基因特征（包括癌症干性或MAIT细胞特征基因）的平均表达值的中位数，将患者分为高风险组和低风险组。使用survival和Survminer R包进行Kaplan-Meier生存分析，以评估组间总生存期的差异。进行多变量Cox比例风险分析，并使用forestmodel包进行可视化。
Enrichment Analysis
使用fgsea对空间转录组数据中肿瘤区域之间的DEG进行Wnt信号通路（MSigDB，M77）的基因集富集分析（GSEA）。在scRNA-seq中，使用Seurat中的AddModuleScore计算恶性肝细胞的癌症干性和Wnt通路评分，干性基因来自CancerSEA。使用AUCell评估空间数据中MAIT细胞和正常/恶性肝细胞的富集情况。使用FindAllMarkers（logFC > 1.5，调整后P < 0.05）从scRNA-seq的TNK亚群中定义MAIT细胞特征。原发性和复发性MAIT特征结合了前50个聚类DEG和原发与复发肿瘤之间的前70个DEG。类似地推导肝细胞特征（logFC > 2.5，调整后p < 0.05）。
Public Data Analysis
从CNP0000650（CNGB序列档案）获取HCC患者的公共单细胞RNA测序数据。该数据集包含来自18名HCC患者（包括12例原发性HCC和6例复发性HCC病例）的肿瘤区域和邻近非肿瘤肝组织的scRNA-seq谱。使用与原研究紧密对齐的工作流程重新处理原始计数矩阵。排除在<3个细胞中检测到的特征以及基因数<200或线粒体基因百分比>10%的细胞。对于总细胞的聚类，选择前20个PC，分辨率参数等于0.8。对于T/NK群体的聚类，在PCA的前15个主成分上运行harmony整合，使用默认参数（theta=2，lambda=1），分辨率参数等于1.5。使用Seurat中的AddModuleScore对公共T/NK细胞群体中我们队列中识别的T/NK细胞亚群进行肝细胞癌症干性评分、特征评分，以及对聚类15中复发性MAIT细胞上调基因的评分。我们队列中每个T/NK亚群的特征基因集使用FindAllMarkers（logFC > 1.0，调整后P < 0.05）从我们scRNA-seq数据的TNK亚群中定义。
Statistical Analysis
所有统计分析均使用R版本4.4.0和GraphPad Prism 9进行。使用标准正态性检验（Shapiro-Wilk和Kolmogorov-Smirnov检验）评估数据分布。对于两组之间的比较，使用t检验分析正态分布数据的未配对差异，或使用Mann-Whitney U检验分析非正态分布数据。统计学显著性设定为P < 0.05。
Results
Distinct Tumor Microenvironment Heterogeneity Between Primary and Relapsed HCC Patients
原发性和复发性HCC在TME中表现出明显的差异，这与肿瘤复发密切相关。为了研究原发性和复发性HCC之间不同的TME及其细胞组成，我们对原发性和复发性HCC患者收集的肿瘤组织进行了scRNA-seq。通过scRNA-seq，使用经典标记基因鉴定了肿瘤组织的主要细胞成分，包括肝细胞（ALB、SERPINA1、KRT18）、T/NK细胞（TRAC、CD3D、NKG7）、髓系细胞（CD68、CD14、LYZ）、B细胞（CD79A、MS4A1、JCHAIN）、内皮细胞（PECAM1、PLVAP、VWF）和成纤维细胞（COL1A1、COL1A2、ACTA2）。
此外，我们使用GeoMx? DSP WTA assay分析了通过scRNA-seq分析的相同HCC患者样本的肿瘤和非肿瘤区域的全转录组，该技术保留了TME内细胞成分的空间背景。我们从5名HCC患者获得了35个ROI。基于H&E染色观察到的形态学和免疫荧光（IF）染色显示CD34表达上调（CD34是HCC血管生成的公认标记物）来识别肿瘤区域。为了比较原发性和复发性HCC肿瘤组织中细胞组成的差异，我们对空间转录组学数据进行了去卷积分析。基于配对scRNA-seq数据中识别的基因表达模式构建了用于去卷积的自定义细胞谱矩阵。使用该矩阵，我们量化了空间转录组数据中细胞群体的丰度。原发性和复发性肿瘤之间细胞簇频率的比较显示，肝细胞（包括恶性细胞）在复发性肿瘤区域显著富集（比原发性肿瘤高1.59倍，p<0.0001）。这种富集伴随着T/NK和成纤维细胞簇频率的降低。
HCC起源于肝细胞，并在其发展过程中经历进行性恶性转化。恶性肝细胞表现出独特的特征，例如增殖、侵袭和免疫逃逸上调，伴随着遗传、表观遗传和改变。这些发现需要对肝细胞簇进行更详细的研究，以阐明复发性HCC中肝细胞增加的原因。
Enhanced Stemness Properties of Malignant Hepatocytes in Relapsed HCC
我们使用Copykat（一种旨在估计基因组拷贝数谱的工具）来定义scRNA-seq数据总细胞中的恶性细胞。与预期一致，只有肝细胞簇由恶性细胞组成。我们证实恶性肝细胞与正常参考细胞相比表现出异常的CNV谱。为了比较原发性和复发性HCC肿瘤组织中恶性肝细胞的富集情况，我们建立了从scRNA-seq数据区分正常和恶性肝细胞的转录特征。对空间转录组数据对这些基因特征进行评分显示，恶性肝细胞在复发性肿瘤区域显著富集（比原发性肿瘤区域高1.10倍，p≤0.05），而正常肝细胞没有显着差异。
最近scRNA-seq技术的进步表明，肿瘤内的癌细胞表现出异质性，并存在于不同的功能状态。恶性肝细胞的DEG分析表明原发性和复发性肿瘤之间存在不同的基因表达模式。复发性肿瘤中的恶性肝细胞显示与癌症干性相关的CXCL2、EGFR和CD44表达显著上调。当我们使用CancerSEA数据库估计癌症干性评分时，复发性肿瘤中的恶性肝细胞表现出上调的干性特性（比原发性肿瘤高1.18倍，p<0.0001）。它们还显示Wnt信号通路上调，该通路在HCC中支持癌症干性和癌细胞过度增殖。此外，空间转录组学数据的GSEA分析进一步证实了与原发性肿瘤区域相比，复发性肿瘤区域中Wnt信号通路的富集（NES=-1.66，p值=0.013）。干细胞样表型或癌症干性已被认为与包括HCC在内的各种癌症类型的肿瘤复发和不良预后相关。实际上，来自TCGA LIHC数据库（n=369）的数据显示，具有高癌症干性特性的患者预后较差（HR=1.87，P < 0.001）。
为了在具有更大样本量的独立队列中进一步验证这些发现，我们使用公开可用的HCC scRNA-seq数据集进行了额外分析。该数据集包含来自18名HCC患者（包括12例原发性HCC和6例复发性HCC病例）的肿瘤区域和邻近非肿瘤区域的单细胞转录组谱。我们重新处理了该数据集，并以与原研究紧密对齐的方式进行了聚类。基于经典标记基因表达进行了广泛的细胞类型注释，确定了六个主要细胞群体：肝细胞、T/NK细胞、髓系细胞、B细胞、内皮细胞和成纤维细胞，与我们自己的数据集一致。使用CancerSEA干性基因集，我们专门计算了这个独立队列中肝细胞的干性评分。与我们的观察结果一致，来自复发性肿瘤区域的肝细胞与来自原发性肿瘤的肝细胞相比，表现出显著更高的癌症干性评分（1.14倍变化，p值<0.0001）。这些数据表明，复发性肿瘤富含具有高干性特性的恶性肝细胞，这与HCC的肿瘤复发和不良预后相关。
Increased Abundance of MAIT Cells in the Tumor Microenvironment of Relapsed HCC
癌细胞与其周围TME之间的相互作用在维持癌细胞干性方面起着关键作用。TME内的肿瘤浸润淋巴细胞可以通过分泌各种趋化因子（如CCL5、IL-1B、IL-6和TGF-β）来促进癌症干性。IF成像显示T细胞与肿瘤细胞的空间邻近定位，表明它们在TME内可能存在相互作用。为了研究这一点，我们对T/NK簇进行了亚聚类，并基于scRNA-seq的基因表达水平鉴定了13个不同的亚群。当比较原发性和复发性肿瘤之间T/NK亚群的分布时，MAIT细胞在复发性肿瘤中似乎更普遍。
为了识别可能参与调节复发性肿瘤中恶性肝细胞富集的癌症干性特性的特定T细胞亚群，我们使用CellPhoneDB包进行了细胞间相互作用分析。有趣的是，恶性肝细胞与每个T细胞亚群之间的细胞间相互作用分析显示，与其他T细胞亚群相比，恶性肝细胞与MAIT细胞的相互作用富集。
此外，我们对空间转录组数据评分了从scRNA-seq数据识别的MAIT细胞特征基因集，以比较其在原发性和复发性肿瘤肿瘤组织中的富集情况。MAIT细胞在复发性肿瘤的肿瘤区域中显著富集（比原发性肿瘤区域高2.71倍，p≤0.05）。
为了进一步验证在复发性肿瘤中观察到的MAIT细胞富集，我们分析了一个独立的公共HCC scRNA-seq数据集。我们重新分析了T/NK细胞群体，并进行了无监督亚聚类，确定了17个不同的亚群。为了将这些亚群与我们的数据集对齐，我们基于它们的DEG从我们的T/NK群体中生成了每个亚群的特征基因集，并将特征评分应用于公共T/NK亚群。该分析确定聚类15是与我们数据集中MAIT细胞最相似的亚群。频率比较表明，聚类15在复发性肿瘤区域比在原发性肿瘤区域更普遍（2.84倍变化，p≤0.05）。总的来说，这些发现表明MAIT细胞在复发性HCC肿瘤中相对富集，并且可能优先与恶性肝细胞相互作用，这提出了MAIT细胞-肿瘤细胞相互作用与复发性HCC中观察到的改变的肿瘤微环境和增强的癌症干性特征相关的可能性。
Dysfunctional Transcriptional States of MAIT Cells and Their Association with Poor Prognosis in Relapsed HCC
为了研究复发性HCC中富集的MAIT细胞的作用，我们比较了原发性和复发性肿瘤之间MAIT细胞的DEG。原发性肿瘤中的MAIT细胞增强了炎症相关基因的表达，包括GNLY、TNF、IFNG、CD40LG和GZMH。相反，复发性肿瘤MAIT细胞显示CXCR4、CCR6、TGFB1和WNT1上调。每个MAIT细胞DEG
