《Bioactive Materials》：M2 macrophage-derived exosomes delivering haptoglobin and interleukin-10 plasmids for synergistic therapy of intracerebral hemorrhage
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本研究针对脑出血（ICH）后继发性神经损伤的临床难题，开发了M2巨噬细胞来源外泌体负载Hp/IL-10双基因质粒的纳米递送系统（M2-exo@HI）。该系统通过靶向M1小胶质细胞，实现血红蛋白（Hb）毒性中和与炎症微环境重塑的双重治疗，显著促进血肿清除、血脑屏障（BBB）修复及神经功能恢复。该策略为出血性脑卒中提供了协同治疗新思路，发表于《Bioactive Materials》。
脑出血（Intracerebral Hemorrhage, ICH）是一种致死率和致残率极高的脑血管疾病，占所有卒中病例的10%–20%，但其死亡率却高达约40%。尽管手术清除血肿是主要的治疗手段，但由于血肿形态不规则、位置深或难以触及，以及再出血风险等因素，其疗效常受限。当前ICH的药物治疗主要集中在血流动力学稳定、并发症预防和颅内压控制，但缺乏能够直接抑制血肿扩大的疾病修饰药物，这严重影响了药物治疗的整体效果。
ICH的复杂病理生理过程，特别是初始出血后发生的进行性继发性脑损伤，使得针对ICH亚急性期的有效治疗策略显得尤为迫切。继发性脑损伤的关键病理机制涉及血肿内红细胞（RBCs）裂解释放血红蛋白（Hb）。Hb降解后释放强效细胞毒素血红素和铁。游离的Hb本身也是一种重要的神经毒素，可驱动氧化应激、炎症反应、血脑屏障（BBB）破坏和神经元死亡。
人体内存在一种天然的防御机制——触珠蛋白（Haptoglobin, Hp），它是一种主要由肝脏和脾脏产生的内源性急性期蛋白，能够以高亲和力结合游离Hb。形成的Hb-Hp复合物可以螯合血红素铁，减轻其促氧化和细胞毒性作用。然而，Hp的治疗潜力受到其在中枢神经系统（CNS）中含量极低且难以穿透BBB的限制。
除了Hb毒性，失调的神经炎症在ICH发病机制中也扮演着关键角色。小胶质细胞作为大脑的常驻免疫细胞，在ICH后被迅速激活并极化为不同的表型：促炎、神经毒性的M1表型或修复性、神经保护性的M2表型。M2小胶质细胞通过分泌抗炎细胞因子促进组织修复。更重要的是，M2小胶质细胞可以通过CD36介导的红细胞吞噬作用和CD163介导的Hb-Hp复合物清除来清除血肿。相反，过度的M1活化会通过释放促炎细胞因子和氧化应激加剧继发性损伤。作为一种关键调节因子，白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）可以促进有益的M2表型，增强小胶质细胞的吞噬能力并保护神经元。鉴于ICH损伤的多方面性，利用IL-10和Hp的协同作用制定联合治疗策略，对于增强出血性卒中中的神经保护和改善功能结局具有巨大潜力。
近年来，巨噬细胞来源的外泌体（Exosomes）作为有前景的CNS药物递送天然纳米载体备受关注。这些囊泡继承了亲本细胞的膜特性和胞质内容物，具有优异的生物相容性、低免疫原性和炎症靶向能力。此外，外泌体能够高效地在细胞间运输多种治疗性货物，包括遗传物质。重要的是，M2极化巨噬细胞来源的外泌体（M2-exo）表面表达某些蛋白质（如甘露糖受体），可通过配体-受体相互作用促进M1小胶质细胞对其选择性摄取。
基于以上见解及现有研究方法，研究人员开发了一种用于ICH治疗的创新协同治疗平台：将编码Hp和IL-10的质粒（HI质粒）装载到M2巨噬细胞来源的外泌体中（M2-exo@HI）。这一工程化的纳米平台利用M2-exo的天然趋向性穿过BBB并在出血部位富集。被M1小胶质细胞内化后，局部表达的IL-10驱动其向保护性M2表型极化，从而增强血肿清除、神经保护和BBB修复。同时，表达的Hp中和细胞毒性Hb，协同减轻炎症和神经毒性。通过同时解决Hb介导的毒性和适应不良的神经炎症这双重病理途径，M2-exo@HI系统为改善出血性卒中结局提供了一种新颖且极具前景的策略。本研究发表于国际期刊《Bioactive Materials》。
为开展此项研究，研究人员运用了多项关键技术方法。首先，通过地塞米松（Dexamethasone, DEX）诱导RAW264.7巨噬细胞极化为M2表型，并采用差速离心法从细胞上清液中分离M2-exo。利用电穿孔法将HI质粒封装入M2-exo中构建M2-exo@HI。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）等手段对M2-exo@HI的粒径、电位、形态等进行表征。在细胞水平，利用脂多糖（LPS）诱导BV2小胶质细胞建立M1表型模型，通过共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞术评估M2-exo的细胞摄取和靶向性。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、Western blot、定量聚合酶链反应（qPCR）等检测Hp和IL-10的表达及功能。通过红细胞吞噬实验、血脑屏障（BBB）通透性实验（FITC-葡聚糖渗透 assay）、神经元凋亡检测等评估体外疗效。在动物水平，采用细菌胶原酶注射法构建小鼠ICH模型，通过近红外荧光活体成像、组织病理学染色（HE、Nissl、TUNEL）、免疫荧光、行为学测试（转棒、圆筒、粘附去除、水迷宫等）以及转录组测序（RNA-seq）等技术，全面评价M2-exo@HI的靶向性、治疗功效、安全性及作用机制。
3.1. M2-exo@HI的制备与表征
研究人员首先使用DEX将RAW264.7巨噬细胞极化为M2表型，并通过流式细胞术和细胞因子检测验证了极化效率。随后通过差速离心从细胞上清中分离出M2-exo，Western blot确认了外泌体标志物（CD9, Tsg101）的表达和内质网标志物（Calnexin）的缺失，证明了外泌体的纯度。成功构建了可同时表达Hp和IL-10的HI质粒（pBudCE4.1-Hp/IL-10），并在293T细胞中验证了其功能。通过电穿孔法将HI质粒装载入M2-exo中，制备得到M2-exo@HI。表征结果显示，M2-exo@HI保持了典型的外泌体杯状形态，粒径约为131.7 nm，电位为-14.0 mV，表明质粒成功装载。M2-exo@HI在酸性pH条件下（pH 6.8）释放更快，显示出pH响应性释放特性，并且在PBS中4°C下储存5天保持稳定。生物相容性实验表明M2-exo@HI对BV2小胶质细胞和内皮细胞（ECs）毒性低，溶血率低于5%，具有良好的血液相容性。
3.2. 体外吞噬作用研究
为了研究M2-exo的炎症靶向能力，研究人员用LPS将BV2小胶质细胞极化为M1表型。然后将近红外染料ICG和罗丹明B（RhB）分别装载到M2-exo中，用于细胞摄取研究。荧光显微镜和流式细胞术分析均表明，与游离染料相比，M2-exo@ICG和M2-exo@RhB被M1小胶质细胞摄取的效率显著更高，且呈时间依赖性。进一步的“摄取-释放”动力学实验表明，在模拟ICH的刺激下，M2-exo主要被BV2细胞内化，胞内RhB含量远高于胞外释放量，支持了“先摄取，后释放”的机制。
3.3. 小胶质细胞中Hp和IL-10表达及Hp/Hb结合的验证
M2-exo@HI将HI质粒递送至M1小胶质细胞后，荧光成像、ELISA、qPCR和Western blot结果均证实了Hp和IL-10的成功表达和分泌。表达量在48-72小时达到峰值。与常规转染试剂Lipo 2000相比，M2-exo在更低质粒剂量下实现了更高的蛋白表达水平，显示了其优越的递送效率。通过免疫共沉淀（Co-IP）实验证实了表达的Hp能够与Hb结合形成Hp-Hb复合物，证明了其功能活性。
3.4. 体外小胶质细胞极化和红细胞吞噬
在利用4%红细胞裂解液模拟的ICH体外模型中，M2-exo@HI处理能显著促进M1小胶质细胞向M2表型极化，CD163+M2型小胶质细胞比例显著增加。同时，M2-exo@HI处理显著降低了促炎细胞因子（IL-1β, TNF-α）的水平，提高了抗炎细胞因子（IL-10, TGF-β）的水平。此外，经过M2-exo@HI处理的M2型小胶质细胞对经t-BHP（叔丁基过氧化氢）诱导衰老的红细胞（RBCs）的吞噬能力显著增强。
3.5. 体外血脑屏障渗漏修复和神经保护
利用bEnd.3细胞构建体外BBB模型，并通过FITC-葡聚糖渗透性实验评估屏障完整性。结果显示，ICH条件导致BBB通透性显著增加，而经M2-exo@HI处理的M2小胶质细胞条件培养基能够有效恢复BBB完整性，减少葡聚糖渗漏。在神经保护方面，将PC12神经元细胞与经不同处理（PBS, HI, M2-exo, M2-exo@HI）的M2小胶质细胞条件培养基共培养后发现，M2-exo@HI组条件培养基能显著减少ICH诱导的神经元凋亡。
3.6. M2-exo的脑靶向及体内Hp和IL-10质粒的表达
通过近红外活体成像技术发现，与游离ICG相比，M2-exo@ICG能更有效地在ICH小鼠的出血侧大脑富集，信号强度在注射后6小时达到峰值。组织分布显示M2-exo@ICG主要蓄积在脑组织。流式细胞术分析表明，M2-exo@RhB主要被脑内的小胶质细胞摄取，而非星形胶质细胞或神经元。阻断实验提示整合素（Integrin）介导的相互作用在M2-exo靶向出血脑组织过程中起主要作用。免疫荧光染色证实，在ICH小鼠脑内，Hp和IL-10的表达主要与IBA-1+的小胶质细胞共定位，表明M2-exo@HI实现了对小胶质细胞的靶向转染。ELISA检测显示，治疗组小鼠出血侧脑组织匀浆中Hp和IL-10的蛋白水平随时间推移而增加。
3.7. 对ICH模型的体内治疗效果
在胶原酶诱导的小鼠ICH模型中，M2-exo@HI治疗能显著减少血肿体积和脑组织血红蛋白含量，减轻脑水肿。免疫荧光分析显示，M2-exo@HI处理有效逆转了ICH诱导的小胶质细胞向M1表型的极化，增加了M2表型（CD163+）的比例。ELISA检测证实，M2-exo@HI治疗降低了脑组织促炎因子（TNF-α, IL-1β）水平，提高了抗炎因子（IL-10, TGF-β）水平。免疫荧光三重标记显示，在M2-exo@HI组，Hb、Hp与Iba-1+小胶质细胞存在明显的共定位，表明Hp结合的Hb被小胶质细胞有效内化清除。组织病理学染色（HE, Nissl, TUNEL）表明，M2-exo@HI治疗减轻了神经元损失和凋亡。Evans blue（EB）染色显示M2-exo@HI治疗显著改善了BBB的通透性。
3.8. M2-exo@HI改善长期神经功能结局
长期行为学测试（包括转棒实验、圆筒实验、粘附去除实验、平衡木实验、改良神经功能缺损评分（mNSS）以及莫里斯水迷宫实验）结果表明，与ICH对照组和HI质粒组相比，M2-exo@HI治疗能显著促进ICH小鼠的运动功能和认知功能的恢复，效果可持续至造模后28天。
3.9. 转录组基因分析
对ICH小鼠脑组织进行转录组测序分析。主成分分析（PCA）显示假手术组、ICH组和M2-exo@HI组样本明显分离。差异表达基因和KEGG通路富集分析揭示，M2-exo@HI治疗显著调控了IL-17信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号通路和铁死亡（Ferroptosis）信号通路。热图分析显示，M2-exo@HI上调了与铁代谢、血红蛋白清除（如Cd163）和组织修复（如Igf2）相关的基因，下调了促炎介质（如Stat3）、趋化因子（如Cxcr4）和基质降解酶（如MMP3/9）的表达。qPCR验证了关键基因的表达变化。通过使用PMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate）激活NF-κB通路进行干预实验，证实了M2-exo@HI的治疗作用部分是通过抑制NF-κB通路实现的。流式细胞术分析还显示M2-exo@HI治疗减少了出血脑组织中CD4+T细胞的浸润。
3.10. 毒性评价与临床转化前景
体内安全性评价显示，M2-exo@HI治疗后小鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）未见明显病理损伤，血常规和血液生化指标均在正常范围内。质粒体内清除动力学研究表明，HI质粒在主要器官中的拷贝数在给药后1周内显著下降，未观察到长期滞留。尽管临床转化仍面临大规模生产、质量控制、储存稳定性等挑战，但M2-exo@HI展现出的良好疗效和安全性为其未来发展奠定了基础。
结论与讨论
本研究成功构建了一种基于M2巨噬细胞来源外泌体的纳米递送平台（M2-exo@HI），用于协同递送Hp和IL-10治疗基因至脑出血病灶。该平台充分利用了M2-exo的天然炎症靶向性和良好的生物相容性，实现了治疗基因在病变部位M1小胶质细胞中的高效、特异性表达。其治疗机制是双重的：一方面，局部表达的Hp有效结合并中和了游离Hb的神经毒性；另一方面，表达的IL-10驱动小胶质细胞向神经保护性的M2表型极化，增强其吞噬清除血肿的能力，并重塑炎症微环境为抗炎状态。这种协同作用最终导致了血肿的有效清除、BBB完整性的修复、神经元凋亡的减少以及神经功能的显著改善。
转录组学分析从分子层面揭示了M2-exo@HI通过协调调控IL-17、NF-κB、PI3K-Akt和铁死亡等多个关键信号通路，综合发挥抗炎、促修复、调节铁稳态和抑制细胞死亡的作用。全面的体内外实验证实了该策略的有效性和安全性。
总之，这项研究不仅为解决ICH治疗中面临的Hb毒性和神经炎症双重挑战提供了一种新颖、高效的协同治疗策略，也展示了生物来源的纳米载体在CNS疾病基因治疗中的巨大应用潜力。M2-exo@HI平台为出血性脑卒中的治疗开辟了新的途径，具有重要的科学意义和临床转化价值。未来的研究将集中于优化生产工艺、完善质量控制和深入理解其体内代谢过程，以推动该技术向临床应用的迈进。
