《Biochimie》：Dioclea violacea Lectin Preserves Brain Mitochondrial Function and Prevents Oxidative Damage after Ischemia/Reperfusion
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本研究探讨植物凝集素DVL在大鼠脑缺血再灌注损伤中的神经保护机制。通过立体定向脑室注射DVL预处理，发现其可改善大鼠运动行为，抑制氧化应激（降低硝酸盐、TBARS和过氧化氢水平），同时维持线粒体呼吸功能（提升氧 consumption和ADP/O比值），并减少钙诱导的线粒体膜通透性转换孔开放。机制研究表明DVL通过特异性结合谷氨酸发挥保护作用。
佩德罗·洛伦佐·奥利维拉·库尼亚（Pedro Lourenzo Oliveira Cunha）| 玛丽亚·斯特拉·巴蒂斯塔·德·弗雷塔斯·内塔（Maria Stella Batista de Freitas Neta）| 卢德米拉·阿劳霍·德·利马（Ludmila Araújo de Lima）| 伊里·桑德罗·潘波利亚·利马（Iri Sandro Pampolha Lima）| 雷纳托·罗德里格斯·罗马（Renato Rodrigues Roma）| 迪奥杰内斯·G·达·S·费尔南德斯（Diógenes G. da S. Fernandes）| 瓦尼乌斯·加西亚（Wanius Garcia）| 克劳德纳·索萨·特谢拉（Claudener Souza Teixeira）| 玛丽亚·伊丽莎白·佩雷拉·诺布雷（Maria Elizabeth Pereira Nobre）| 赫伯特里·塔尔索·法昆多（Heberty Tarso Facundo）
巴西卡里里联邦大学（Universidade Federal do Cariri）医学院，巴尔巴拉（Barbalha），塞阿拉州（CE）
摘要
缺血性脑损伤的特征是线粒体功能障碍和氧化应激。在再灌注过程中，线粒体产生的活性氧会引发细胞损伤。线粒体钙离子流入失调会触发线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放，从而破坏线粒体功能并导致细胞死亡。Dioclea violacea凝集素（DVL）是一种植物凝集素，具有多种生物活性。本研究旨在探讨DVL在缺血性中风大鼠模型中的体内治疗效果及其机制。在缺血前15分钟，通过立体定向脑室内注射（体积1 μl）给予DVL（0.5 μg）或生理盐水。通过双侧颈动脉阻塞诱导30分钟的全球性脑缺血。再灌注24小时后，我们评估了运动能力、氧化应激标志物（亚硝酸盐、硫代巴比妥酸反应物质-TBARS、线粒体H2O2水平以及超氧化物歧化酶（SOD）活性）、线粒体氧消耗量和ADP/O比值（使用Clark型电极）。MPTP的开放通过Ca2+诱导的肿胀来检测。结果表明，DVL在缺血前给药可对大鼠脑组织产生神经保护作用，恢复其探索行为并减轻抑郁症状。DVL处理的大鼠线粒体氧消耗率和ADP/O比值有所改善。此外，DVL还降低了氧化应激（线粒体H2O2生成、TBARS和亚硝酸盐水平），并保持了SOD活性。从DVL处理的大鼠中分离出的线粒体对Ca2+诱导的MPTP开放具有较低的敏感性。从机制上看，DVL能够结合谷氨酸——这是一种在缺血后大量释放的兴奋性毒性神经递质。本研究揭示了一种新的植物凝集素通过保护线粒体和减轻氧化应激发挥神经保护作用的机制。
引言
中风事件通常是由于脑动脉血流阻塞（超过80%，即所谓的缺血性中风）引起的，会导致死亡和持续的健康损害[1]。由于血液供应受损，葡萄糖和氧气供应不足，会破坏脑细胞稳态，引发一系列病理生理现象，包括兴奋性毒性、氧化应激、炎症、细胞凋亡和细胞死亡[2]。及时再灌注可能挽救脑组织免受中风损伤。然而，这一过程不仅能够挽救缺血组织，还会引发不可逆的损伤。重要的是，线粒体功能障碍是神经元再灌注损伤的核心[3]。功能失调的线粒体会产生高水平的活性氧（ROS），影响ATP的生成并导致额外的细胞损伤[4]。因此，需要设计针对性的神经保护干预或药物治疗来减轻线粒体功能障碍和氧化应激引起的细胞损伤。目前尚无研究探讨凝集素是否可以通过靶向线粒体来保护大脑免受缺血/再灌注损伤。
线粒体功能障碍是缺血性脑损伤的标志。在脑缺血/再灌注过程中，受损的线粒体是细胞ROS的主要来源[3]、[5]、[6]。值得注意的是，ROS会损害脂质、蛋白质和DNA，其参与再灌注损伤的作用可追溯到20世纪80年代初[7]。生理上，ROS的产生和清除由促进剂和抗氧化剂之间的动态平衡维持。在脑缺血和再灌注过程中，这种平衡被打破，导致ROS积累增加和细胞损伤[3]、[5]、[6]。此外，线粒体通过以膜电位依赖的方式隔离钙离子，在维持细胞稳态中起着关键作用[8]。这种钙缓冲能力对于保护神经元免受兴奋性毒性至关重要，后者表现为细胞内钙离子过度流入，从而导致细胞死亡和氧化应激[8]。有趣的是，增强线粒体钙缓冲能力的干预措施可以防止兴奋性毒性及相关神经退行性疾病[9]。线粒体钙离子流入失调会触发线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放——这是一个不受控制的非特异性线粒体孔道，会破坏线粒体功能并导致细胞死亡。MPTP的开放使线粒体内膜对分子通透性增加（高达1500 Da），破坏质子梯度，导致氧化磷酸化以及促凋亡因子的释放[10]。MPTP的开放由细胞内钙离子积累、氧化应激和其他细胞死亡信号触发。实际上，所有这些事件都是脑缺血和再灌注的结果[11]、[12]。因此，线粒体功能障碍和氧化应激可能是延缓或阻止缺血/再灌注引起的脑损伤的潜在治疗靶点。
凝集素被用于研究蛋白质-碳水化合物相互作用的分子基础和糖链的结构特征[13]。除了其已知的糖链结合能力外，一些植物凝集素还具有额外的配体特异性，能够通过疏水相互作用结合非蛋白质氨基酸、黄酮类化合物、植物激素和其他分子[14]。这些多样的相互作用使凝集素能够发挥广泛的生物活性，包括与微生物学[15]、炎症[16]、镇痛[17]、血管形成[18]、血管舒张[19]和神经保护[20]相关的功能。此外，由于凝集素能够与中枢神经系统中的糖缀合物相互作用，并影响神经可塑性、神经行为效应和潜在的神经保护作用，因此它们在神经生物学研究中具有应用潜力[21]。在植物凝集素中，Dioclea violacea凝集素（DVL）是研究最为深入的一种。它是一种由237个氨基酸组成的单体凝集素，通过寡聚化形成二聚体或四聚体[22]。DVL具有多种生物活性，包括抗肿瘤作用[23]、调节抗生素活性[24]和肾脏保护作用[25]。鉴于线粒体功能障碍和氧化失衡在缺血性脑损伤中的核心作用，以及凝集素在调节与细胞应激和存活相关的上游信号通路中的潜力，我们假设DVL可能是一种具有保护脑线粒体功能的未探索的生物活性分子。据我们所知，这一可能性在脑缺血背景下尚未被研究过。
本文研究了植物来源的凝集素DVL对脑缺血和再灌注损伤的神经保护作用。通过阻断双侧颈动脉30分钟来诱导全身性脑缺血，然后允许血液流动24小时以实现再灌注。DVL处理的大鼠认知功能与健康对照组（假对照组）相似，表明DVL保护了脑细胞。此外，DVL还改善了线粒体呼吸和氧化磷酸化，表明其增强了线粒体功能。DVL还降低了再灌注后缺血脑组织中的氧化应激。
药物和试剂
所有化学品均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。氯胺酮和赛拉嗪（xylazine）来自巴西圣塔纳-德帕尔奈巴（Santana de Parnaíba）的K?nig实验室。其他所有试剂均为分析级。
动物
雄性Wistar大鼠（250克）被饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，自由提供水和标准饲料。该项目已获得卡里里联邦大学动物实验机构委员会的批准，批准号为#107/2015。
Dioclea violacea凝集素（DVL）的纯化
收集了
DVL可阻断脑缺血损伤
为了研究DVL阻断脑缺血损伤的能力，我们分析了手术后24小时内（如材料与方法部分所述）大鼠的穿越行为、站立行为和梳理行为的次数（无论是否接受DVL处理）。图1A显示，经过30分钟颈动脉阻塞的大鼠穿越行为显著减少（这是动物探索行为的指标）。站立行为也是如此（大鼠用来感知周围环境的方式）
讨论
本研究证明，脑室内注射植物来源的凝集素DVL可以保护脑组织免受缺血-再灌注损伤。DVL减轻了由缺血和再灌注引起的线粒体功能障碍。此外，DVL处理组表现出对Ca2+诱导的MPTP开放较低的敏感性，同时H2O2生成减少，超氧化物歧化酶活性保持不变。DVL处理还抑制了脂质过氧化和亚硝酸盐的形成。
CRediT作者贡献声明
雷纳托·罗德里格斯·罗马（Renato Rodrigues Roma）：验证、方法学、研究。迪奥杰内斯·G·达·S·费尔南德斯（Diogenes G. da S. Fernandes）：验证、方法学、研究。玛丽亚·斯特拉·巴蒂斯塔·德·弗雷塔斯·内塔（Maria Stella Batista de Freitas Neta）：验证、方法学、研究。卢德米拉·阿劳霍·德·利马（Ludmila Araújo Lima）：验证、方法学、研究。克劳德纳·索萨·特谢拉（Claudener Souza Teixeira）：撰写-审稿与编辑、方法学、资金获取、概念构思。玛丽亚·伊丽莎白·佩雷拉·诺布雷（Maria Elizabeth Pereira Nobre）：撰写-审稿与编辑、方法学、概念构思。瓦尼乌斯·加西亚（Wanius Garcia）：验证，
数据获取
利益冲突声明
作者声明与本文内容无关的任何利益冲突。
资助
本工作部分由巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq）资助，资助对象为Claudener Souza Teixeira（资助编号313421/2023-4），以及巴西高等教育人员培训协调委员会（Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES）（资助编号001）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们特别感谢Anna Lidia Nunes Varela博士提供的技术支持。佩德罗·洛伦佐·奥利维拉·库尼亚（Pedro Lourenzo Oliveira Cunha）获得了UFCA的研究奖学金。
