《BioDesign Research》：Efficient synthesis of optically pure D-lactate from mixed sugars by engineered
E. coli consortium
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本研究针对碳分解代谢物抑制(CCR)效应限制混合糖利用效率的难题，通过代谢工程构建了葡萄糖专化型(GL10)和木糖专化型(XL12)大肠杆菌，形成分工协作的合成菌群。该菌群在混合糖发酵中实现了葡萄糖完全消耗和53.21%木糖利用率，D-乳酸产量达3.76 g/L（较野生型提高5.96倍），光学纯度达100%。研究通过调控摇床转速(50-250 rpm)和接种比例(1:1至1:15)，优化发酵性能，并在玉米秸秆水解液中验证其应用潜力，为生物基D-乳酸生产提供了新策略。
随着全球对可持续发展和生物基材料需求的日益增长，聚乳酸(PLA)作为一种可生物降解的聚合物，在替代石油基塑料方面展现出巨大潜力。其中，立体复合聚乳酸(SC-PLA)由D-乳酸和L-乳酸共聚而成，具有优异的热稳定性和机械性能，但其工业化应用受限于高光学纯度D-乳酸的规模化生产瓶颈。目前，化学合成法生产的乳酸为外消旋混合物，需要复杂的手性分离工艺，而微生物发酵法虽能直接合成光学纯乳酸，却面临碳分解代谢物抑制(CCR)效应导致的混合糖利用效率低下问题。特别是木质纤维素水解液中含有葡萄糖和木糖等混合糖，如何实现其协同高效转化成为生物制造领域的关键挑战。
为解决这一难题，湖北大学生命科学学院的研究团队在《BioDesign Research》发表论文，通过合成生物学策略构建了人工大肠杆菌菌群，实现了混合糖向光学纯D-乳酸的高效转化。研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大肠杆菌BL21(DE3)进行代谢工程改造，敲除副产物合成途径关键基因（如丙酮酸甲酸裂解酶pflB、磷酸转乙酰酶pta等），构建了葡萄糖专化型菌株GL10和木糖专化型菌株XL12。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证基因敲除效果，利用高效液相色谱(HPLC)分析代谢产物，并系统评估了摇床转速、接种比例等发酵参数对菌群性能的影响，最终在玉米秸秆水解液中验证其工业化应用潜力。
3.1. 菌株构建
通过CRISPR/Cas9技术成功构建XL12（缺失glk、ptsI等11个基因）和GL10（缺失pps、poxB等8个基因）工程菌。qRT-PCR分析显示，XL12中磷酸葡萄糖异构酶pgi、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc等基因表达显著下调，表明代谢流成功导向D-乳酸合成。
3.2. 木糖利用菌株发酵性能
阶段性构建的中间菌株XL5（缺失glk等5个基因）在葡萄糖培养基中生长延迟，但能将D-乳酸产量提升至2.66 g/L（转化率53.2%）。升级版XL12在木糖为唯一碳源时产量达2.66 g/L，且副产物（琥珀酸、甲酸等）未检出。在混合糖发酵中，XL12可同步利用56.57%木糖，但葡萄糖仍对木糖利用存在抑制。
3.3. 葡萄糖利用菌株发酵性能
GL10在葡萄糖培养基中产量达3.15 g/L（转化率63%），光学纯度100%。但在混合糖体系中，尽管葡萄糖快速消耗，木糖利用率几乎为零，表明单一菌株策略难以克服CCR效应。
3.4. 混合糖共发酵
GL10与XL12以1:1比例形成的菌群在36小时内实现葡萄糖完全消耗和53.21%木糖利用，D-乳酸产量较野生型提高5.96倍。提高摇床转速至250 rpm可促进菌体生长，但D-乳酸产量在150 rpm时最优（3.76 g/L），表明溶解氧水平调控碳流分配。当接种比例调整为GL10:XL12=1:5时，产量进一步提升至4.53 g/L，但过量XL12可能因能量代谢限制抑制木糖利用。
3.5. 玉米秸秆水解液验证
菌群在脱毒处理后的水解液中产量达5.15 g/L，较野生型提高41.87%，证明其在实际原料中的适用性。但发酵后期pH降至4.5-5.0，提示酸耐受性改良是未来优化方向。
该研究通过代谢分工策略成功规避了单菌系统的代谢冲突，首次实现了工程菌群在混合糖中同步高效转化D-乳酸。其创新性在于：通过精确敲除磷酸转移酶系统(PTS)关键基因glk/ptsI，重塑木糖代谢网络；利用菌群互补性克服CCR效应；发现溶解氧与接种比例对代谢流的调控规律。研究成果为木质纤维素生物炼制的工业化提供了关键技术支撑，也为复杂底物利用的合成生态系统设计提供了范式参考。未来通过整合酸耐受性改造与过程优化，有望进一步提升D-乳酸的经济性。
