《Bioresource Technology Reports》：Engineering microbial cells for optimal biohydrogen production: a concise review of process control and metabolic engineering
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本综述系统探讨了通过代谢工程（ME）和基因组编辑技术（如CRISPR-Cas9）提升微生物暗发酵（DF）生物制氢（BioH2）产量的前沿策略。文章重点分析了消除竞争途径（如敲除ldhA、frdD基因）、解除碳分解代谢阻遏（CCR）以促进混合糖利用、以及重定向代谢流（如过表达Mdh、MaeA、[Fe-Fe]氢酶）等关键方法。同时，综述还评估了过程工程参数优化以减轻产物毒性（如VFAs抑制）的策略，并展望了结合多组学数据和机器学习模型推动BioH2工业化应用的未来方向。
1. 引言
全球能源需求的激增以及对化石燃料的严重依赖，是导致全球变暖的主要因素。在此背景下，源自可再生资源的清洁能源——生物氢（BioH2），因其高热值和生产利用过程中的零碳排放特性而备受关注。在各种生物制氢技术中，微生物暗发酵技术展现出利用可再生生物质生产高氢产量的巨大潜力。然而，尽管付出了巨大努力，许多暗发酵过程仍难以达到理想的氢气产率。代谢工程和基因组工程为改造微生物、提高发酵过程中的氢气生产率提供了强大工具。本综述旨在阐述该领域的研究现状，重点讨论通过代谢和基因组工程增强生物制氢能力的策略。
2. 生物制氢的代谢工程方法
野生型产氢微生物的氢气产量通常低于其理论潜力。代谢工程通过精确操控细胞过程，可开发出具有增强产氢能力的新表型。关键策略包括消除竞争途径、解除碳分解代谢阻遏以及重定向代谢流。
2.1. 消除竞争途径
产氢细菌会产生乙酸、乙醇、乳酸和甲烷等竞争性副产物，这些副产物会分流碳、能量和电子，从而降低整体氢产量。通过敲除特定基因，如编码富马酸还原酶的frdD基因和编码乳酸脱氢酶的ldhA基因，可以显著提高氢产量。例如，在大肠杆菌（Escherichia coli）中敲除这两个基因可使H2产量比野生型提高2.5倍。此外，调控甲酸代谢（例如通过操纵focA基因）和修饰NADH途径（例如通过移除FHL阻遏蛋白编码基因hycA）也是有效的策略。
2.2. 解除碳分解代谢阻遏以实现混合糖利用
木质纤维素等生物质原料含有多种糖类，但微生物通常存在碳分解代谢阻遏（CCR）现象，即优先利用葡萄糖等优选碳源，限制了其他碳源（如木糖、阿拉伯糖）的产氢能力。通过敲除磷酸转移酶系统（PTSGlc）的相关基因（如ptsG, crr, ptsI, ptsH），或删除araC等调控基因，可以解除CCR，实现葡萄糖和木糖等糖类的同步消耗，从而有效提高氢气产量。
2.3. 重定向代谢流
该策略旨在引导碳、能量和还原力（如NADH）流向产氢途径，同时减少不必要的副产物。代谢流分析（MFA）是理解和优化这一过程的关键工具。通过基因删除研究结合基因组尺度模型，可以预测和优化代谢途径。研究表明，调节水力停留时间（HRT）和pH值等参数可以影响代谢流，进而影响氢产量。将代谢工程工具与基因组编辑方法相结合，有望在工业条件下实现稳定高效的产氢。
3. 基因组编辑方法：CRISPR-Cas基因组编辑工具
与传统代谢工程工具相比，CRISPR-Cas系统因其高遗传稳定性、较低的技术复杂性和强大的放大稳定性而受到更多关注。该系统能够对微生物基因组进行精确、高效的遗传修饰。例如，利用CRISPR-Cas9技术敲除产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）IAM1183的nuoC, nuoD, nuoE等NADH脱氢酶亚基基因，可分别使产氢量提高24.5%和45.6%。该技术还可用于过表达[Fe-Fe]氢酶、抑制[Ni-Fe]氢酶、敲除乳酸脱氢酶（Ldh）等，以增强发酵产氢。然而，CRISPR-Cas在某些严格厌氧菌（如梭菌属Clostridium spp.）中的应用仍面临转化和编辑效率低、Cas蛋白毒性以及工程菌株在大型生物反应器中长期稳定性等挑战。
4. 重组基因表达策略
重组基因表达是通过在宿主生物中引入并表达目的基因来生产特定蛋白质或代谢产物的关键技术，包括同源基因表达和异源基因表达。
4.1. 同源基因表达
该策略通过过表达宿主自身的产氢关键基因（如氢酶基因）来增强产氢。例如，过表达苹果酸脱氢酶（Mdh）和苹果酸酶A（MaeA）可引导碳流向丙酮酸，进而促进H2合成。在产气肠杆菌中过表达甲酸氢裂解酶激活因子基因fhlA，能显著提高FHL活性，从而使利用棉秆水解液的产氢量提高188%。类似策略在肠杆菌属、埃希氏菌属、梭菌属和克雷伯氏菌属中均有成功应用。
4.2. 异源基因表达
该策略将外源基因引入宿主菌，以赋予或增强其产氢能力。例如，将大肠杆菌的非编码RNA RyhB异源表达于克雷伯氏菌中，可使产氢率提高近50%。将肺炎克雷伯氏菌的nadE基因（参与NADH途径）在产气肠杆菌中表达，可增加NADH可用性，从而将代谢流导向产氢。将来自荚膜红细菌（Rhodospirillum rubrum）的[Fe-Fe]氢酶基因及其成熟蛋白基因在大肠杆菌中共表达，也能显著提高氢酶活性和产氢量。不过，异源表达体系的遗传稳定性和效率仍是需要持续研究的问题。
5. 增强底物利用
底物利用效率对暗发酵产氢至关重要。利用代谢工程改造微生物，使其能够直接降解木质纤维素等复杂生物质并产氢，可以减少预处理步骤，降低成本。例如，从牛瘤胃中分离并改造的大肠杆菌ZH-4菌株，能够降解玉米秸秆中的纤维素和半纤维素，并从中产氢。此外，利用粗甘油、有机城市固体废物、啤酒糟、糖蜜和腐烂椰枣等废料作为底物生产氢气，也为废物资源化提供了新途径。补充氨基酸等营养物质也被证明可以优化底物利用，提高产氢量。
6. 优化工艺工程参数以降低毒性
产物毒性是规模化微生物产氢的主要障碍之一。在暗发酵阶段产生的挥发性脂肪酸（VFA）、氨、硫化物、重金属离子以及预处理过程中产生的呋喃醛、酚类等抑制剂，会严重抑制微生物生长和产氢活性。工艺优化策略主要包括稀释和去除抑制剂、灭活抑制剂以及调整操作参数。
6.1. 稀释和去除抑制剂
通过定期更换部分发酵液（如30%-50%）以稀释积累的VFA，可以缓解pH下降和产物抑制。使用生物炭吸附、电动力学、生物浸出等方法可有效去除重金属离子。补充铁离子（Fe2+）可以沉淀硫离子，减轻硫化物毒性。
6.2. 灭活抑制剂
采用酸处理、碱处理、热处理或酶处理（如胰蛋白酶）等方法，可以灭活或降解硫代硫酸盐、细菌素、酚类化合物等抑制剂。利用基因工程微生物直接转化利用这些抑制剂，也是一种经济有效的方法。
6.3. 调整操作参数
优化碳氮比（C/N）、食物微生物比（F/M）、pH值、温度、搅拌速度等参数至关重要。例如，将pH维持在6.2-6.8范围内可抑制硫酸盐还原菌和甲烷菌的活性。热休克处理（55-65°C，30分钟）或施加40 mV外部电压也能有效抑制甲烷菌。在优化条件下（如37°C，200 rpm），工程菌株能实现更高的产氢效率。
7. 结论与未来展望
代谢工程和基因组编辑技术为大幅提高生物制氢效率提供了强大动力。通过消除竞争途径、解除碳分解代谢阻遏、重定向代谢流以及应用CRISPR-Cas9等工具，已在实验室和中试规模上取得了显著进展。未来研究应侧重于：利用多组学数据和机器学习模型深入理解并优化细胞系统；开发混合途径工程和合成微生物群落；解决氢酶氧敏感性问题；探索经济有效的毒性抑制物综合缓解策略；以及将遗传改造与工艺参数优化紧密结合。这些努力将推动生物制氢技术的工业化进程，为环境可持续的清洁能源未来做出贡献。
