《Current Opinion in Microbiology》：Genetic toolbox development for engineering
Bacteroides and other bacterial species
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本综述系统探讨了非模式细菌（特别是拟杆菌属）合成生物学工具箱的开发策略，重点介绍了遗传元件传递与维持、可控基因表达、基因组编辑及先进工具应用等关键技术，为工程化活体疗法和诊断工具的开发提供了重要方法论指导。
引言
微生物工程与合成生物学的交叉领域正在重塑生物医学研究的格局。传统研究多聚焦于实验室常用菌株的改造，但近年来，利用非模式共生菌和益生菌开发原位工程化活体治疗或诊断机器的兴趣日益浓厚。拟杆菌属作为人类肠道微生物组中的优势菌群，因其低致病性、持久定植能力和宿主适应性成为理想工程化平台。然而，有效遗传操作新物种常需开发新工具，这推动了针对非模型细菌的合成生物学工具箱的快速发展。
遗传元件的传递与维持
实现微生物工程化功能的首要步骤是建立遗传物质向目标菌株的高效传递和稳定维持系统。质粒作为最常用的遗传载体，其基本功能依赖于复制起点（Ori）和选择标记。隐性质粒（如拟杆菌中的pBI143）是Ori的重要来源，但通常需要构建大肠杆菌-拟杆菌穿梭载体以确保在克隆宿主和目标菌株中的功能性。对于转化效率低的细菌（如拟杆菌），接合转移成为主要递送方法，需要载体包含转移起点（OriT）并使用特定供体菌株（如E. coli S17–1 λpir）。
选择标记方面，抗生素抗性基因（如红霉素、四环素抗性基因）最为常用，其适用性可通过药敏试验或基因组生物信息学预测确定。替代策略是营养缺陷型互补，通过删除必需代谢基因并在质粒上反式补充，将质粒维持与生长优势耦合，这种方法可避免抗生素抗性基因的环境扩散，更适用于临床。此外，基因组整合能实现遗传元件的稳定维持，无需持续施加选择压力，并降低质粒高拷贝复制带来的代谢负担，同时通过避免染色体外质粒的水平基因转移提高生物安全性。
可控基因表达
精确调控基因表达是工程化微生物的核心。转录启动子和核糖体结合位点（RBS）的选择决定了蛋白表达的水平和可调性。拟杆菌的RBS缺乏典型的Shine-Dalgarno（SD）序列，其翻译起始更依赖于核糖体蛋白结合而非SD序列-16S rRNA相互作用，因此RBS强度的预测准确性较低。解决方案包括从高表达蛋白中挖掘天然强效RBS或筛选随机序列文库。
启动子可分为组成型和诱导型。通过转录组学分析在不同培养条件下持续高表达的基因，可鉴定其启动子用于构建组成型表达工具。例如，在拟杆菌中已鉴定出一系列强度各异的组成型启动子。噬菌体基因组也是强效启动子的重要来源，如源自B. fragilis靶向噬菌体的PBfP1E6启动子是当前拟杆菌中最强的组成型启动子。
对于需要精确时空调控的应用，诱导型启动子至关重要。天然诱导型启动子可通过转录组学分析细菌在特定诱导物（如不同碳源）处理下的差异表达基因来发现。例如，在B. thetaiotaomicron中已开发出对甘露聚糖、葡聚糖、鼠李糖和阿拉伯半乳聚糖响应的天然诱导系统。此外，广宿主范围的调控系统（如LacI/lacO、TetR/tetO）可通过在组成型启动子中插入操作子序列来构建合成诱导型启动子，实现在拟杆菌中对IPTG、脱水四环素（aTC）、胆汁酸和亚硝酸盐/硝酸盐的响应。
基因组修饰
基因组编辑工具可实现基因敲除、突变及稳定整合，是微生物工程的高级手段。等位基因交换利用同源重组（HR）和“自杀载体”介导靶向基因替换，载体设计包含同源臂、选择标记及（如需无痕编辑）反选择标记。该方法已用于拟杆菌的疤痕基因组工程。
整合酶系统（如丝氨酸/酪氨酸整合酶）介导质粒在预定义位点（如attB位点）的特异性基因组整合。常用的拟杆菌基因组整合载体包括pNBU1和pNBU2，它们可用于插入基因表达盒甚至实现基于重组酶的遗传记忆功能。转座子则介导近乎随机的基因组插入，适用于大规模诱变和功能基因组学研究。在拟杆菌中，转座子诱变已用于鉴定与适应性相关的必需基因及特定表型相关基因。
CRISPR/Cas系统因其宿主非依赖性的核酸酶活性和通用DNA修复机制，已成为细菌基因组编辑的强大工具。其可编程性允许高效、多位点编辑，且无需选择标记。CRISPR/Cas系统已被整合到大肠杆菌-拟杆菌穿梭载体中，在多种拟杆菌中实现高效率的基因插入、删除和碱基编辑。最近，CRISPR/Cas系统与转座酶结合，实现了大型多基因操作子在原生小鼠B. thetaiotaomicron体内的原位插入，展示了其治疗应用潜力。
先进工具开发与应用
复杂转录编程
将单个遗传组件组合成复杂遗传电路，可使微生物执行多输入逻辑运算。例如，在拟杆菌中，多个诱导型启动子与向导RNA表达耦合，通过催化失活Cas9（dCas9）介导的启动子抑制，实现了布尔运算控制报告蛋白表达。更复杂的电路通过整合多组阻遏蛋白和抗阻遏蛋白，实现了更高级的逻辑运算和电路压缩。这种能力促进了感知-响应系统的开发，为治疗、诊断等应用提供了更精细的控制。
蛋白分泌与表面展示
许多应用需要工程化菌将蛋白载荷分泌到胞外或展示在细胞表面。革兰氏阴性菌（如拟杆菌）的双膜结构使其分泌系统更为复杂。早期研究利用B. fragilis肠毒素的信号肽，在B. ovatus中实现了木聚糖诱导的人角质细胞生长因子-2和转化生长因子-β的分泌，成功缓解小鼠炎症性结肠炎。近期，通过筛选B. thetaiotaomicron的内源性分泌蛋白，鉴定出一套拟杆菌分泌载体（信号肽和全长蛋白），实现了异源蛋白在拟杆菌属中的高效分泌。
蛋白表面展示通常通过将 cargo 蛋白与锚定在外膜的天然蛋白（如脂蛋白、孔蛋白等）融合来实现。近期研究证实，通过将荧光蛋白与脂蛋白BT_2844和OmpF孔蛋白融合，可在B. thetaiotaomicron表面实现靶向展示。
生物传感
转录调控因子、双组分系统和核糖开关等生物元件常被用于构建细菌生物传感电路。许多转录调控因子受特定化合物调控，为构建化合物特异性诱导型启动子生物传感器提供了资源。双组分系统通过感应小分子配体激活靶基因表达。核糖开关是mRNA内的非编码调控元件，结合配体后通过构象变化调控基因表达。尽管将拟杆菌开发为生物传感器的兴趣增长，但其可用的传感模块仍远少于大肠杆菌，这仍是未来的重要目标。
结论与未来方向
细菌工程化工具箱的开发建立在基础生物学研究之上，并推动着对新发现的探索。例如，近期B. thetaiotaomicron的高分辨率转录组学研究揭示了其基因组编码的许多小RNA和核糖开关，可用于生物传感和遗传电路设计。双膜跨抗σ因子（Dma）蛋白家族的发现为工程化新型生物传感器（尤其是检测无法进入细胞的大分子）提供了潜在靶点。
然而，将工程化益生菌和共生菌应用于治疗诊断仍面临挑战，特别是菌株定植和生物防护。近期研究表明，通过CRISPR相关转座酶介导的精确原位基因编辑，可能规避外源接种菌的定植限制。其他方法旨在完全避免使用遗传物质，例如利用原生拟杆菌的木葡聚糖水解活性激活糖缀合物前药。尽管拟杆菌是已知的共生菌，但许多物种被认为是机会致病菌，这需要通过更严格的生物安全措施和清晰的临床监管指南来解决。基因组精简或合成基因组构建可用于改善菌株的临床适用性。因此，除了优化遗传电路以实现更复杂的功能外，将这些修饰生物体安全有效地应用于实验室之外，还需要严格的工程化控制策略。
