《Environmental Pollution》：Trichloroethylene induces cardiomyocyte senescence through an AhR–ROS–IL-1 axis and amplified by Wnt/β-catenin suppression
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三氯乙烯通过激活芳烃受体（AhR）引发氧化应激和DNA损伤，抑制Wnt/β-catenin通路，促进IL-1β炎症介导的心肌细胞衰老，并验证了其在斑马鱼模型中的机制。
冯浩斌|张倩|傅宝强|尚长毅|吴亚茹|张雅欣|姜斌|陈涛|姜岩
中国江苏省苏州市苏州医学院附属第一医院
摘要
三氯乙烯（TCE）是一种普遍存在的地下水污染物，已被流行病学研究证实与心血管疾病有关，但其引发心脏衰老的潜在机制尚未明确。我们利用H9c2心肌细胞和斑马鱼幼体，研究了TCE诱导心脏衰老的分子机制。暴露于环境相关剂量的TCE（60 μg L-1）会引发显著的心脏早衰现象，表现为细胞形态扁平化、衰老相关SA-β-gal活性升高、p16/p21表达上调以及Lamin B1水平下降，但不会影响细胞的急性活力。机制上，TCE通过激活芳烃受体（AhR）通路，导致活性氧（ROS）过量产生和ATM依赖性的DNA损伤。药物抑制AhR、清除ROS或阻断ATM均可阻止衰老过程。转录组分析显示IL-1是ROS下游的主要衰老相关分泌型细胞因子。重要的是，IL-1受体拮抗剂能够减轻DNA损伤并逆转衰老标志物，从而形成一个促进心脏衰老的正反馈炎症循环。同时，AhR通过上调β-连环蛋白降解复合体的成分，抑制了经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路，进一步加剧了IL-1驱动的炎症。使用GSK-3β抑制剂恢复Wnt活性后，IL-1表达减少，衰老现象得到缓解。体内实验结果验证了体外研究结果：AhR信号通路、氧化DNA损伤、Wnt通路抑制以及p53/p21介导的心脏衰老均得到证实，证明了该机制的临床相关性。这些发现表明TCE是心脏早衰的外源性诱因，并揭示了AhR-IL-1通路作为缓解环境加速心脏衰老的潜在治疗靶点。
引言
自20世纪初以来，三氯乙烯（TCE）被广泛用作工业溶剂，用于金属脱脂和干洗，已成为危险废物场所中最常见的有机污染物之一[1][2]。尽管美国环保署（EPA）采取了严格的监管措施，但在工业化地区的地下水和饮用水中TCE污染仍然普遍存在，且常常超过最大污染物限值。最新监测数据显示，饮用水中的TCE浓度范围为20至200 μg/L，职业吸入暴露的浓度更高[3]。TCE的半衰期受氧化还原条件和微生物活动的影响显著：在厌氧条件下其半衰期为数月至4.5年，而在有氧条件下仅为2天至1年[4]。其迁移能力使其能够长期累积，带来持续的环境风险。这种普遍存在的暴露情况对健康构成长期威胁[5]。TCE及其代谢物主要通过细胞色素P450酶代谢[6]，并与多种不良心血管疾病相关[7]，尤其是慢性暴露与心血管死亡率增加有关，包括动脉粥样硬化[8]、高血压[9]、缺血性心脏病和中风[10]的风险升高。尽管流行病学证据表明两者之间存在关联，但关于TCE如何直接加速心脏衰老过程的直接机制仍不明确。
与年龄相关的心血管疾病是全球死亡的主要原因，每年导致约2050万人死亡[11]。除了传统风险因素外，环境污染物越来越多地被视为可改变的心血管病理驱动因素，但它们在直接促进心脏细胞衰老中的作用仍需进一步研究[12]。细胞衰老是组织衰老的基本机制，其特征包括细胞周期不可逆停滞、促炎性分泌表型（SASP）、抗死亡能力和功能逐渐下降[13]。衰老细胞的积累会导致与年龄相关的心力衰竭中的不良重塑和收缩功能障碍[14]。虽然生理衰老过程中的端粒缩短是复制性衰老的原因，但外部压力（如DNA损伤[15]和氧化应激[16]）可独立于端粒长度引发应激诱导的早衰。这形成了一个正反馈炎症循环，其中SASP因子加剧了组织层面的衰老[17]。针对TCE暴露的工人和居民的流行病学研究一致显示系统性的氧化应激和炎症生物标志物升高[18]。然而，缺乏直接证据证明TCE会导致心肌细胞衰老，以及启动这一反应的上游信号事件。
芳烃受体（AhR）是环境压力的关键传感器。除了其在异生物质代谢中的传统作用[19]，最新研究还发现AhR激活与神经[20]和皮肤[21]系统的早衰密切相关。我们之前的研究已表明AhR参与了PM2.5引起的心脏异常[22]，但其在TCE介导的心脏衰老中的作用尚不明确。
AhR与Wnt/β-连环蛋白通路之间的相互作用可能放大这种效应[23]。Wnt/β-连环蛋白信号通路在调节细胞增殖、分化和程序性细胞死亡中起重要作用，尤其是在心血管病理过程中[24]。当前研究强调了Wnt/β-连环蛋白信号通路在年龄相关调节机制和机体稳态维持中的重要性[25][26]。然而，Wnt信号通路对心肌细胞衰老的具体贡献仍需进一步研究。Wnt/β-连环蛋白信号通路调节炎症和衰老的精确机制仍有待阐明。
H9c2细胞常用于评估心脏毒性。我们的先前研究表明，TCE暴露会导致H9c2细胞处于未分化状态并异常增殖[27]，但这种模型无法充分反映心脏特异性病理[28]。分化后的H9c2细胞对药物和毒性刺激更敏感，更准确地反映了成熟心肌细胞的反应[29]。因此，我们使用分化后的H9c2细胞作为主要机制平台，研究TCE诱导的衰老及其潜在的上游信号事件。为了探讨这些通路的体内生理相关性和进化保守性，我们采用了斑马鱼幼体模型，这是一种快速且易于遗传操作的系统，用于评估心脏对TCE暴露的反应。
化学物质
三氯乙烯（TCE，CAS79-01-6，纯度99.5%）购自Adamas-beta（上海，中国），储存温度为4°C。制备100 ppm储液时使用DMSO稀释，该溶液随后储存在-20°C。CH223191（CH，CAS：301326 -22 -7）、阿纳白酶（Anakinra，CAS：HY-108841）和KU-55933（CAS：HY-12016）购自MedChemExpress（上海，中国），NAC（N-乙酰-L-半胱氨酸，CAS：S0077）购自Beyotime（上海，中国）。CHIR（CHIR99021，
TCE对分化H9c2心肌细胞活力和形态变化的影响
在本研究中，我们首先评估了TCE对分化H9c2心肌细胞活力和形态特征的影响。如图1A所示，经过5天的分化处理后，包括Myom2、Myog、Sln和Tnnt2在内的心脏特异性标记物的表达水平显著升高，证实H9c2肌母细胞成功分化为类似心肌细胞的细胞。为了评估TCE暴露对细胞活力的影响，我们对细胞进行了处理
讨论
本研究揭示了一种新的机制：普遍存在的环境污染物三氯乙烯通过激活AhR，引发活性氧过量产生并抑制Wnt/β-连环蛋白通路，从而协同放大IL-1驱动的炎症和ATM依赖的DNA损伤，最终导致心肌细胞衰老。
结论
本研究阐明了TCE诱导心肌细胞衰老的机制：AhR激活导致ROS过量产生并抑制Wnt/β-连环蛋白通路，两者共同放大促衰老炎症反应并引发DNA损伤（图8）。我们的工作证实了AhR/IL-1通路在环境污染物引起的心脏毒性中的关键作用，为缓解心脏衰老提供了有希望的治疗靶点。
作者贡献声明
冯浩斌：撰写初稿、软件使用、方法设计、实验实施、数据管理、概念构思。陈涛：审稿与编辑、项目监督、资金筹集、概念构思。姜岩：审稿与编辑、撰写初稿、项目监督、资金筹集、概念构思。张雅欣：方法设计。姜斌：结果验证、资源获取、资金筹集。尚长毅：软件使用、方法设计、数据分析
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82171689和81972999）和江苏省高等教育机构重点学术发展计划的支持。
