蜡质米以其独特的粘性和糯性、多孔结构以及出色的保水能力而广用于粽子、传统糕点、汤圆和米酒的制作（Shoukat等人，2025年）。蜡质米淀粉具有独特的成分，支链淀粉（amylopectin）含量高达99.70%，而直链淀粉（amylose）含量较低（Kang等人，2010年）。支链淀粉具有高度分支的结构，含有α-1,4和α-1,6糖苷键，分子量较大，形成了更紧密的短程有序结构（Murray & Phisarnchananan，2014年）。消化酶容易攻击其非晶区域，在消化过程中迅速将其转化为葡萄糖（Kaur等人，2016年），导致血糖水平急剧上升，因此被归类为高血糖指数食品（Farooq & Yu，2025年）。长期食用蜡质米可能会增加心血管疾病的风险（Ali & Hashim，2024年；Singh等人，2010年）。蜡质米淀粉含有较多的短链，因此在糊化后比普通米淀粉具有更强的抗回生能力。然而，由于支链淀粉外部链的重排，长期储存后仍会变硬（Hsieh等人，2019年）。蜡质米淀粉的消化性和回生行为受其颗粒大小、支链淀粉的链长分布及其结构组织的影响（Singh等人，2010年）。因此，了解蜡质米淀粉的结构、降低其消化性并延缓其回生对于其在健康淀粉基食品中的应用至关重要。
通过发现和应用特定的淀粉水解酶，可以对淀粉进行体外酶修饰，有效抑制回生并降低消化性，从而调节链长和分支密度（Zhai等人，2022年）。Amylosucrase可以将蔗糖的葡萄糖基团转移到稻米支链淀粉的非还原末端。Pullulanase特异性切割稻米支链淀粉中的α-1,6糖苷键，生成低DP（聚合度）的α-1,4葡聚糖链。蜡质米淀粉的延长支链（Kim等人，2016年）和去支链的α-1,4葡聚糖链（Zeng等人，2015年）分别容易形成螺旋结构。双螺旋结构的形成通过氢键和其他分子间相互作用增强了它们的组织性和稳定性。因此，破坏双螺旋结构并熔化结晶结构需要更高的能量（Guo等人，2020年）。
α-1,4-葡聚糖分支酶（BE）可以切割稻米支链淀粉外部葡聚糖链的α-1,4糖苷键，将α-1,4连接的葡萄糖基团转移到同一葡聚糖链或邻近葡聚糖链的C-6羟基上。这一作用增加了分支点的数量和短链的比例。β-淀粉酶通过从非还原末端释放麦芽糖单元，进一步缩短支链，并增加BE修饰后淀粉的α-1,6糖苷键含量（Xu等人，2025年）。葡糖淀粉酶（GA）从淀粉的非还原末端断裂糖苷键，释放β-葡萄糖单元。这一过程产生了更多DP 6-12的支链，这些支链适合作为后续BE修饰的底物。双酶修饰的淀粉显著增加了短链的数量，并降低了结构刚性。
这些酶单独或联合使用，改变了淀粉的关键结构参数，如α-1,6糖苷键与α-1,4糖苷键的比例以及结晶度。这种重构使得淀粉对酶消化的抵抗力增强，表现为缓慢消化淀粉和/或抗性淀粉的比例增加。
4,6-α-葡聚糖转移酶是一种属于GH70糖苷水解酶家族的新型α-葡萄糖转移酶（Kralj等人，2011年）。与其他利用蔗糖作为葡萄糖供体的酶不同，4,6-α-葡聚糖转移酶在麦芽寡糖和淀粉中催化内部转糖基化反应。该反应生成连续的α-1,6键或引入短链，从而形成异麦芽糖和麦芽多糖或类Reuteran多糖。根据其结构域排列，4,6-α-葡聚糖转移酶进一步分为三种类型：GtfB、GtfC和GtfD（Rao等人，2022年）。这些类型具有不同的底物特异性和产物结构。来自Geobacillus sp. 12AMOR1的GsGtfC酶是已知最耐热的4,6-α-葡聚糖转移酶之一（Li等人，2022年）。这种卓越的耐热性使得淀粉在高温下转化的同时保持酶的结构完整性和催化活性，从而降低底物粘度并减少微生物污染。这一特性与大多数在嗜温或嗜冷条件下发挥作用的4,6-α-葡聚糖转移酶明显不同（te Poele等人，2021年）。
在本研究中，基于氨基酸比对、酶-底物对接和分子动态模拟，通过定点突变技术构建了5个活性增强的GsGtfC突变体。与野生型GsGtfC相比，这些突变体产生了更高比例的短链，这些短链具有抗结晶性，并且仅被肠道异麦芽糖酶缓慢去支链。这些结构变化降低了淀粉的回生性，并改善了其缓慢消化性能。本研究不仅基于新发现阐明了关键氨基酸残基在4,6-α-葡聚糖转移酶活性中的作用，还建立了关键氨基酸残基与淀粉结构/消化性/回生之间的关系。这些发现展示了4,6-α-葡聚糖转移酶在开发体内缓慢释放葡萄糖的新谷物食品方面的巨大潜力。
