《Food Bioscience》：Structural elucidation and anti-osteoporosis activity of polysaccharides obtained from
Quasipaa spinosa skin
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Quasipaa spinosa皮肤多糖QSP II-2经结构鉴定为分子量4.6 kDa的α-葡萄糖苷，其作用机制是通过上调Runx2b等成骨基因和下调Ctsk等破骨基因实现抗骨质疏松，并在zebrafish GIOP模型中验证了疗效。
张凌宇|鞠亚欣|黄一颖|苏德金|邓宁|李健
厦门集美大学海洋食品与生物工程学院，中国厦门361021
摘要
糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIOP）是最常见的继发性骨质疏松症类型。我们在GIOP斑马鱼模型中研究了Quasipaa spinosa皮肤多糖（QSP II-2）的结构特征和抗骨质疏松活性。通过HPAEC、FTIR、GC-MS和NMR光谱技术对QSP II-2的结构进行了表征，确定其是一种分子量为4.6 kDa的α-葡聚糖，并进一步确认其重复单元由→3,6)-α-D-Glcp-(1→和→6)-α-D-Glcp-(1→残基组成，侧链主要由连接在→3,6)-α-D-Glcp-(1→的O-3上的α-D-Glcp-(1→构成。功能研究表明，QSP II-2显著增强了患有GIOP的斑马鱼的颅骨矿化作用，表明其对骨质疏松具有保护作用。机制分析显示，QSP II-2通过上调成骨细胞相关基因（Runx2b、Runx2a、Col1a2、Alp和Sp7）来促进骨形成，同时通过下调破骨细胞相关基因（Ctsk、Nf-κb2、Nfatc1和Acp5）来抑制骨吸收。综上所述，这些发现支持Quasipaa spinosa皮肤可作为功能性食品中抗骨质疏松剂的潜在来源。
引言
骨质疏松症（OP）是一种常见的骨骼疾病，对全球公共卫生构成重大挑战。临床上，OP可分为原发性和继发性两种类型，其中约40%的病例属于继发性骨质疏松症（Ebeling等人，2022年）。最常见的继发性骨质疏松症类型是糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIOP），由长期使用糖皮质激素（GCs）引起。这种医源性状况给全球医疗系统带来了巨大的临床和社会经济负担。因此，越来越多的研究致力于发现具有预防GIOP潜力的天然食品活性化合物。
Quasipaa spinosa是一种广泛分布于中国南部亚热带山区的两栖动物，因其高营养价值而被传统上用作药材和食物，尤其是丰富的蛋白质来源（王勇 & 谢晓，2024年）。先前的研究报道Q. spinosa含有多种生物活性物质。例如，曾等人（2024年）从中提取了一种具有显著抗氧化能力的肽；吴等人（2024年）发现Q. spinosa皮肤中的肽可通过NRF2-KEAP1途径发挥抗氧化作用；此外，多项研究表明Q. spinosa皮肤中的肽具有抗菌和抗氧化活性（董等人，2015年）。这些发现表明Q. spinosa的副产品（如皮肤）可能具备超出其营养价值的功能性成分潜力。最近，关于天然多糖抗骨质疏松活性的研究逐渐增多。例如，多毛鹿角多糖可通过刺激MAKP和MMP-9信号通路抑制骨吸收并改善骨丢失（刘等人，2023年）；源自几丁质的天然< />-乙酰-D-葡萄糖胺可增加小梁骨体积并改善股骨的生物力学性能（江等人，2018年）；Polygonatum sibiricum多糖可通过Wnt/β-连环蛋白信号通路治疗骨质疏松症（杜等人，2016年）。这些多糖具有多样的结构，表明它们可能具有抗骨质疏松作用。Quasipaa spinosa皮肤富含钙和多糖，表明其可能对骨质疏松具有保护作用。
在本研究中，我们从Quasipaa spinosa皮肤中分离并纯化出一种新的多糖，命名为QSP II-2，并利用单糖组成分析、傅里叶变换红外（FT-IR）光谱、气相色谱质谱（GC-MS）和核磁共振（NMR）光谱技术对其结构进行了详细表征。随后在GIOP斑马鱼模型中评估了QSP II-2的抗骨质疏松潜力，该模型是一种评估骨骼疾病的有效且可靠的系统，具有光学透明度高、骨骼发育迅速、易于基因操作、繁殖能力强及维护成本低等优点（Geurtzen等人，2017年；Howe等人，2013年）。此外，我们还检测了与骨质疏松相关的基因表达，以探究QSP II-2的作用机制。
材料与试剂
Quasipaa spinosa由双泉农业有限公司（中国福建）提供。DEAE-纤维素52和Sephadex G-100凝胶购自Solarbio有限公司（中国北京）。标准单糖来自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。斑马鱼胚胎购自上海鱼生物有限公司（中国上海）。泼尼松龙和阿仑膦酸钠购自Macklin有限公司（中国上海）。茜素红S购自Aladdin有限公司（上海）。
QSP II-2的纯化
从Quasipaa spinosa皮肤中提取的粗多糖（QSP）的产率为约2.83%。通过DEAE-52纤维素柱分离得到三个组分：QSP I、QSP II和QSP III（图2A）。主要组分QSP II进一步在Sephadex G-100柱上纯化，得到两个亚组分QSP II-1和QSP II-2（图2B），其中QSP II-2是主要组分，被选用于后续分析。
讨论
GIOP被认为是最常见的继发性骨质疏松症类型（Messina等人，2021年）。因此，近年来人们对潜在的抗骨质疏松化合物进行了大量研究。在本研究中，我们成功从Quasipaa spinosa皮肤中提取并纯化出一种新的多糖（QSP II-2），结果表明QSP II-2主要由Glc组成，分子量为4.6 kDa。结构分析显示其
结论
本研究从Quasipaa spinosa皮肤中提取并纯化了多糖，并对其结构进行了表征。结果表明，QSP II-2主要由Glc组成，分子量为4.6 kDa，其重复单元由→3,6)-α-D-Glcp-(1→和→6)-α-D-Glcp-(1→残基构成，侧链主要由连接在→3,6)-α-D-Glcp-(1→的O-3上的α-D-Glcp-(1→构成。此外，我们发现QSP II-2表现出优异的治疗效果。
CRediT作者贡献声明
李健：监督、资源获取、概念构思。苏德金：资源提供、实验研究。邓宁：资源提供、实验研究。鞠亚欣：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、资源提供、实验研究。黄一颖：数据可视化、资源提供、实验研究。张凌宇：撰写 – 审稿与编辑、结果验证、项目管理、资源获取、概念构思
未引用参考文献
Wang等人，2018年；Zhang等人，2019年。
利益冲突声明
? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：张凌宇报告称获得了中国国家自然科学基金的支持。如果有其他作者，他们也声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国农业研究生教育国家指导委员会（资助编号：2021-NYYB-20）以及福建省海洋生物医学资源工程研究中心（资助编号：XMMC-OP202310）的支持。
