基于固态发酵：通过非酿酒酵母（Non-Saccharomyces cerevisiae）的优先作用调控白酒强香气类型中的酯类生成

《Food Bioscience》：Based on solid-state fermentation: Regulation of ester formation through priority effects of non-Saccharomyces cerevisiae in strong aroma type of Baijiu

智能手机辅助的 Fe3O4-Zr@Cys-Cu 双酶纳米传感器通过 EXPAR-CHA 双信号放大机制实现 Salmonella 高灵敏度检测（检测限 3×10^0 CFU/mL，线性范围 3×10^0-3×10^5 CFU/mL），磁分离结合颜色显色（苯醌衍生物）通过 RGB 智能手机读数完成，适用于复杂样本的现场快速检测。

　　

乔静波|马晨静|刘意迪|于欣|林彤|焦静波|黄玉坤|王硕|杜新军

天津科技大学食品科学与工程学院食品营养与安全国家重点实验室，天津300457，中国

摘要

沙门氏菌是一种主要的食源性病原体，对全球公共卫生和经济稳定构成严重威胁。及时可靠的沙门氏菌检测对于有效预防食源性疾病至关重要。本文报道了一种新型的超灵敏智能手机基比色适配体传感器，该传感器结合了级联信号放大技术的强信号放大能力和Zr@Cys-Cu双酶催化的高效率（具有类似磷酸酶和漆酶的活性）。指数放大（EXPAR）可被沙门氏菌特异性触发，生成单链目标DNA，进而引发催化发夹反应（CHA），使Fe₃O₄与Zr@Cys-Cu结合。经过磁分离后，收集到的Fe₃O₄-Zr@Cys-Cu用于比色检测，最终比色信号由智能手机处理。Fe₃O₄-Zr@Cys-Cu适配体在检测沙门氏菌时表现出优异的灵敏度和特异性，线性范围为3×10⁰-3×10⁵ CFU/mL，检测限为3×10⁰ CFU/mL。整个检测过程可在2小时内完成。该系统能够在复杂样品基质中检测分析物。结合智能手机的便携性，这种适配体传感器成为一种强大的即时检测（POCT）工具，具有广泛的应用潜力。

引言

沙门氏菌是一种主要的食源性病原体，对全球公共卫生和经济稳定构成严重威胁（Sun, Feng, Zhang, Quan, Hua, & Zhang, 2025b）。沙门氏菌爆发带来的经济后果巨大，包括高昂的医疗费用、生产力损失以及食品召回对相关行业声誉的损害。尽管政府和研究机构在监测和控制沙门氏菌方面投入了大量资源，但由于受污染样品中病原体浓度低和食品基质的复杂性，检测仍然具有挑战性（Yuan, Wang, Duan, Ye, Ding, Li, et al., 2024）。传统的检测方法如微生物培养技术、基于抗原-抗体相互作用的免疫学检测方法（Flynn, Wu, Bantle, Isaacson, Chang, Mahmud, et al., 2025; Liang, Wang, Gong, Zhang, Wang, Cao, et al., 2023; Preechakasedkit, Pulsrikarn, Nuanualsuwan, Rattanadilok Na Phuket, Citterio, & Ruecha, 2024）和聚合酶链反应（PCR）（Hadi, Rapp, Dhawan, Gupta, Gupta, & Brightwell, 2023）虽然具有高度特异性，但耗时、依赖仪器且需要专业操作人员（Jiang, Wu, Kim, An, Nam, Peng, et al., 2023; S. Wu, Sheng, Lu, Ye, Sun, Ji, et al., 2024）。因此，开发高效灵敏的沙门氏菌快速检测方法对于维护食品安全、及时预防和控制疫情以及减轻这种广泛存在的食源性病原体带来的公共卫生风险至关重要。

近年来，基于等温扩增技术的多种方法已被开发出来，包括环介导的等温扩增（LAMP）（Qiao, Jia, Peng, Lu, Li, Man, et al., 2024）、杂交链反应（HCR）（Wang, Feng, Xiao, & Luo, 2025）、滚环扩增（RCA）（Sun, Feng, Zhang, Quan, Hua, & Zhang, 2025a）、链置换聚合酶扩增（SDA）（Yapeng Wu, Lv, Ni, Zhu, & Li, 2025; Jiamin Xu, Liu, Zhao, Wang, Gui, Li, et al., 2022）和重组酶聚合酶扩增（RPA）（Y. Li, Liu, Zhao, Liang, Chen, & Yang, 2025）。其中，指数放大反应（EXPAR）基于扩增酶和内切酶，能够在短时间内高效扩增10⁶-10⁹ ssDNA（Y. Li, Liu, Zhao, Liang, Chen, & Yang, 2025; Y. Liu, Shi, Wang, Liu, Shang, Zhao, et al., 2024）。催化发夹扩增（CHA）是一种无需酶的扩增方法，具有高扩增效率、良好的生物相容性和简单工艺的优点（J. Xu, Luo, Chen, Guo, Jia, & Wang, 2025）。双核酸扩增技术的协同应用策略提高了检测灵敏度，因此有望通过EXPAR与CHA的结合建立超灵敏检测技术。然而，当前的等温扩增平台主要依赖传统染料作为信号显示，这些染料不仅光稳定性差且成本高，也不适合即时检测（POCT）。

比色方法因其简单性、良好的可视性和快速性而在快速分析技术中受到越来越多的关注。然而，现有的比色传感器技术主要依赖天然酶催化的底物产生信号，存在成本高、环境要求严格和稳定性不足等缺点（Gao, Ye, Ding, Wu, Zhao, Deng, et al., 2024）。纳米酶作为一种模拟酶的纳米材料，因其独特的优势（包括可调的催化活性、增强的稳定性和成本效益）而受到广泛研究（M. Yang, Wang, Su, Zhu, Xie, & Ying, 2024）。纳米酶被视为天然酶的潜在替代品，已被广泛应用于重金属离子、农药残留和肿瘤标志物的检测。特别是基于锆（Zr）的纳米酶在模拟磷酸酶（PPA）活性方面显示出巨大应用潜力，可以催化P-O键的水解和切割，生成磷酸基团和羟基自由基（G. Song, Li, Majid, Xu, He, Yao, et al., 2022; Y. Wu, Chen, Wang, & Xing, 2023）。此外，基于铜（Cu）的纳米酶作为漆酶（LAC）的模拟物，可以催化酚类化合物，被认为是环保的绿色催化剂，在生物传感器和生物医学领域具有显著应用价值（L. Yang, Guo, Zheng, Zhang, Yao, Xu, et al., 2023）。酶级联反应（PPA-LAC）可以避免使用有毒底物，促进精确的信号传递，为设计安全高效的生物传感器提供了新策略。此外，智能手机上的预装应用程序（APPs）可以帮助快速收集和识别颜色变化，使用RGB（R=红色，G=绿色，B=蓝色）作为读出信号，其与比色传感器的结合为实时和用户友好的食品污染物检测方法提供了有力支持（Y. Yang, Liu, Mu, Meng, Mao, Tao, et al., 2024）。

鉴于上述优势，本研究开发了一种基于双核酸信号放大技术的智能手机辅助比色传感器，结合了Zr@Cys-Cu的双酶活性，称为Fe₃O₄-Zr@Cys-Cu适配体（方案1）。在此策略中，分别通过水热反应制备了Cys-Cu、ZrOx-OH和Fe₃O₄。随后，通过Cys-Cu@PEI与ZrOx-OH之间的静电自组装合成了具有双酶活性的Zr@Cys-Cu。此外，通过强Zr-O-P键将磷酸化修饰的发夹（H1）固定在Zr@Cys-Cu上，形成H1-Zr@Cys-Cu；同时，发夹2（H2）通过生物素-链霉亲和力与Fe₃O₄-SA结合，形成Fe₃O₄-SA-H2（方案1a）。在沙门氏菌存在下，适配体特异性识别沙门氏菌，释放出C-Apt，后者与HP杂交后与TP结合，在KF聚合酶的作用下引发扩增反应。扩增反应生成含有Nb.BbvCl识别位点的新序列，Nb.BbvCl将其切割为目标物质和C-Apt类似物。同时，释放的C-Apt及其类似物进入下一个EXPAR循环，目标物质激活CHA反应，从而促进Zr@Cys-Cu与Fe₃O₄的连接。经过磁分离后，进行Zr@Cys-Cu催化的双酶级联反应。利用其PPA类似活性，Zr@Cys-Cu水解二钠苯基磷酸盐（PPDS）的P-O键，释放出酚类物质。生成的酚类物质随后被材料的LAC类似活性氧化，与4-氨基酚（4-AP）结合，生成红色苯醌亚胺衍生物（QI）用于比色分析（方案1b）。制备的Fe₃O₄-Zr@Cys-Cu适配体结合了双酶活性和双扩增机制，通过智能手机平台上的简化RGB识别操作实现沙门氏菌的可视化检测。这种创新的传感策略为食品安全应用中的高效病原体筛查提供了有前景的解决方案。

材料与化学品

N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯化铜（II）二水合物（CuCl₂·2H₂O）、氯化铁（III）六水合物（FeCl₃·6H₂O）、乙二醇和氢氧化钠（NaOH）购自Aladdin（上海，中国）。L-半胱氨酸和Klenow Fragment（Exo-）购自Solarbio Biotechnology Co.（北京，中国）。四氯化锆（ZrCl₄）、对苯二甲酸（H₂BDC）、戊二醛溶液、乙二胺、链霉亲和素（SA）、聚乙烯亚胺（PEI）、4-硝基苯基磷酸二钠盐购自其他供应商。

H1-Zr@Cys-Cu和Fe₃O₄-SA-H2的特性

通过TEM观察了Zr@Cys-Cu和Fe₃O₄的表面形态。如图1a和b所示，ZrOx-OH呈现球形形态，表面光滑，大小约为100 nm；而Cys-Cu呈现较小的圆形形态，大小约为10 nm。通过ZrOx-OH和Cys-Cu的静电自组装制备的Zr@Cys-Cu则呈现表面粗糙的球形，尺寸较大，这是由于Cys-Cu吸附在ZrOx-OH上所致（图1c）。

结论

总体而言，本研究利用新型纳米酶Zr@Cys-Cu与级联信号技术建立了一种创新的智能手机辅助比色检测平台，能够快速、准确、便携地检测沙门氏菌。得益于分子检测和纳米复合材料的巧妙结合，Fe₃O₄-Zr@Cys-Cu适配体实现了高灵敏度和特异性检测，检测限低至3×10⁰ CFU/mL，显示出良好的应用前景。

CRediT作者贡献声明

焦静波：实验研究。黄玉坤：实验研究。于欣：软件开发。林彤：实验研究。马晨静：初稿撰写与审稿编辑。刘意迪：实验研究。乔静波：初稿撰写与审稿编辑。王硕：项目监督、软件开发与资源提供。杜新军：项目监督与资金筹集

未引用参考文献

Liu et al., 2025; Wu et al., 2025; Xu et al., 2022; Yang et al., 2024.

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了天津市自然科学基金（25JCQNJC00830）、国家重点研发计划（2023YFF1103900）、天津市科技计划项目（24YDTPJC00950）、四川省食品微生物学重点实验室开放项目（FM2025-28）和国家自然科学基金（32472322）的支持。