转谷氨酰胺酶介导的预交联对大豆蛋白和脱氨蛋清蛋白热诱导凝胶化特性的影响

《Food Chemistry》：Effect of transglutaminase-mediated pre-crosslinking on the thermally induced gelation properties of soy protein and deaminated egg white protein

本研究通过转谷氨酰胺酶（TGase）介导的预交联优化大豆蛋白 isolate（SPI）与去酰胺蛋清蛋白（DEWP）复合凝胶的机械性能，发现80U/g TGase 120min处理可使凝胶硬度提升至1240.32g（SPI组1269.94g）、持水能力达98.22%，并增强三维网络结构，分子间作用以共价键为主，为植物基肉制品开发提供新策略。

　　

梁贵江|陈文普|王兆军|陈秋明|曾毛毛|何志勇|道格拉斯·戈夫|陈杰

江南大学食品科学与技术学院，中国无锡214122

摘要

本研究通过转谷氨酰胺酶（TGase）介导的大豆蛋白分离物（SPI）与脱酰胺蛋清蛋白（DEWP）之间的交联，探讨了大豆蛋白基凝胶的改良方法。在不同TGase浓度（10–80 U/g）和孵育时间（60–240分钟）下制备了蛋白质复合物，并进行了热诱导凝胶化实验。粒度分析、分子量分布测定、SDS-PAGE电泳、原子力显微镜（AFM）以及流变学分析表明，增加TGase浓度或孵育时间能够促进蛋白质通过ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键发生交联，从而形成凝胶网络。使用80 U/g TG酶处理120分钟的样品显示出最高的硬度和持水能力（WHC）：硬度分别为1269.94 g vs 124.02 g；WHC分别为98.22% vs 88.63%。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和分子间力分析显示，TGase交联增强了二硫键的形成，同时减少了氢键和疏水相互作用。这些结果为TGase介导的SPI-DEWP凝胶化机制提供了见解，并为其在植物基肉类替代品和大豆蛋白基加工肉制品中的应用提供了潜在可能性。

引言

对动物蛋白的依赖加剧了自然资源的消耗，并可能带来严重的环境问题（Dekkers等人，2018年；Kumar等人，2017年）。在饮食中加入高质量的植物蛋白作为动物蛋白的替代品已被证明可以降低人类健康风险并促进环境可持续性（Qin等人，2022年）。例如，大豆蛋白分离物（SPI）具有均衡的氨基酸组成、良好的功能特性、健康益处以及较低的成本。然而，大豆蛋白在制备富含蛋白质的凝胶时仍面临挑战，包括热不稳定性和酸性稳定性差、凝胶结构脆弱且持水能力（WHC）低、质地粗糙等问题（He等人，2024年；Renkema，2004年）。因此，调整大豆蛋白的凝胶性质对于开发满足快速增长的植物基蛋白市场需求的多样化食品配方至关重要。

大豆蛋白由7S（α, α' 和 β）和11S（酸性A和碱性B多肽）组成，含有羟基、羧基和氨基等官能团（Zheng等人，2022年）。这些官能团在热处理过程中可以通过疏水相互作用、分子间二硫键、离子相互作用和共价交联形成蛋白质网络（Wu等人，2019年）。传统上，提高配方中11S/7S的比例可以增强凝胶的固态特性，因为11S球蛋白中的碱性多肽具有较高的疏水性，有助于通过疏水相互作用形成较大的聚集体（Wu等人，2017年）。然而，大聚集体的存在会对化学交联凝胶的储存模量和WHC产生负面影响，导致凝胶网络结构变得粗糙（Liang等人，2024年）。转谷氨酰胺酶（TGase）被用于改善大豆蛋白凝胶，因为它能催化谷氨酰胺（Gln）残基的γ-羟胺基团与赖氨酸（Lys）残基的ε-氨基团之间的酰基转移反应，从而形成分子间或分子内交联（Zhang等人，2020年）。这一过程显著提升了SPI凝胶的流变性能，使其三维凝胶网络更加致密和均匀（Qin等人，2016年；Qin等人，2017年）。此外，SPI的不同亚基在TGase催化的分子相互作用中表现出不同的能力。7S亚基由于具有更灵活、开放的分子结构，表面暴露出更多的谷氨酰胺（Gln）和赖氨酸（Lys）残基，更容易被TGase催化和聚合（Liang等人，2025年）。然而，11S亚基具有更紧凑的球状四级结构，聚合能力较弱，主要发生在酸性亚基中，碱性亚基的参与程度较低（Zang等人，2019年）。因此，经TGase处理的大豆蛋白凝胶通常比基于动物蛋白的凝胶（如酪蛋白凝胶）更脆弱，弹性 and 坚韧性较低（Zang等人，2019年）。除非添加适量平衡的成分或进行超声处理或高压处理，否则这些凝胶往往保水性差，质地易碎或干燥（Mao等人，2022年）。

本研究采用PGase介导的蛋清蛋白（EWP）脱酰胺方法，以提高其与SPI的相容性。EWP含有丰富的反应位点，有助于形成更致密的蛋白质网络（Zhang等人，2020年），因此被用于补充SPI的交联效率。EWP因其营养价值、易消化性、高生物利用度和完整的氨基酸组成而受到关注，是凝胶加工的理想候选材料（Dong & Zhang，2021年；Zhang等人，2019年）。EWP是一种包含多种成分的蛋白质混合物，如卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵粘蛋白和溶菌酶（Dong & Zhang，2021年）。作为EWP的主要成分，卵白蛋白含有许多自由巯基（SH），这些巯基可以通过热处理形成二硫键，从而赋予基于鸡蛋的制品弹性质地（Van der Plancken等人，2005年）。尽管EWP天然富含Gln和Lys残基，为TGase催化提供了丰富的底物位点，但其高热敏感性和紧凑的分子结构使其容易发生快速自聚和过早凝胶化（Alavi等人，2020年）。在高TGase浓度下，SPI和EWP的混合物可以同时发生三种交联途径：SPI-SPI、EWP-EWP和SPI-EWP。Zhang等人（2020年）的研究表明，在40°C下使用TGase处理鸡蛋可形成更致密、更细腻的凝胶网络，从而改善机械性能和WHC。然而，上述TGase诱导的凝胶在工业食品加工中仍存在实际限制。例如，在生产含大豆蛋白的肉制品时，蛋白质需在约40°C下孵育一小时以形成稳定的TGase介导的凝胶。这种长时间的孵育操作复杂且增加了微生物生长的风险。因此，在实际生产中，通过预交联蛋白质后再进行热诱导凝胶化，是一种更高效、结构稳定且微生物安全的凝胶制备方法。

为克服这些限制，本研究旨在通过TGase介导的SPI和EWP之间的预交联来构建混合蛋白质热诱导凝胶。为了减轻蛋清蛋白的强自聚效应并提高其与SPI的相容性，使用蛋白谷氨酰胺酶（PGase）选择性脱酰胺，将Gln残基转化为谷氨酸，同时保留Lys残基。这一策略显著提高了EWP的溶解性（Hamada & Swanson，1994年；Liu等人，2022年），促进了SPI-SPI和SPI-EWP之间的交联，并抑制了EWP-EWP的自交联。这种方法不仅促进了更广泛且可控的蛋白质网络的形成，还在后续高温加热过程中促进了二硫键的形成，进一步增强了凝胶的稳定性。通过多种分析手段阐明了复合凝胶的结构和相互作用动态，包括交联程度评估、结构表征、蛋白质组成分析、凝胶性质研究以及相互作用力分析。总体而言，本研究提出了一种新的蛋白质工程策略，结合了酶促脱酰胺和TGase介导的交联，从而在分子水平上调控蛋白质间的相互作用，制备出具有可调结构和功能特性的高性能SPI-EWP复合热诱导凝胶。这种方法在植物基肉类替代品和基于大豆蛋白的加工肉制品中具有广泛应用潜力。

材料

大豆（Taiwan 292）购自中国无锡的当地超市。蛋清蛋白（EWP）从云南生物科技有限公司（上海）购买。转谷氨酰胺酶（TGase，2000 U/g）购自江苏泰兴的东升生物科技有限公司。蛋白谷氨酰胺酶（PGase，500 U/g）购自日本名古屋的爱美浓酶工业公司。30%聚丙烯酰胺溶液、β-巯基乙醇（βME）、考马斯亮蓝和四甲基乙烯二胺（TEMED）均购自Sigma-Aldrich公司。

交联程度和粒度分布

TGase对蛋白质分子的交联对于形成稳定、有弹性的凝胶结构至关重要，尤其是在乳制品替代品等特定食品应用中。这一过程涉及Gln残基的γ-羧酰胺基团与Lys残基的ε-氨基团之间的共价ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键的形成（Ouyang等人，2021年；Qin等人，2016年）。图1A展示了不同样品（S0至S6）经TGase处理后的交联程度（%）。

结论

总之，与未经处理的SPI和物理混合物（S0）相比，TGase催化的SPI和DEWP之间的预交联显著增强了热诱导蛋白质凝胶的结构组织和机械性能。这种交联主要通过SPI中的Gln残基与DEWP中的Lys残基之间形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键来实现。TGase诱导的SPI-SPI/SPI-DEWP分子交联促进了蛋白质聚集

作者贡献声明

梁贵江：撰写——初稿撰写、数据可视化、实验设计、数据分析。陈文普：撰写——初稿撰写。王兆军：资源提供。陈秋明：资源提供。曾毛毛：资源提供。何志勇：资源提供。道格拉斯·戈夫：撰写——审稿与编辑。陈杰：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹集。

未引用参考文献

Jiang等人，2022年

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2024YFF1106500）和江南大学食品科学与资源国家重点实验室研究计划（项目编号：SKLF-ZZB-202515）的财政支持。