利用多孔石墨碳液相色谱-轨道阱串联质谱技术对异麦芽寡糖进行连接结构解析的表征

《Food Chemistry》：Linkage-resolved profiling of isomalto-oligosaccharides using porous graphitic carbon liquid chromatography–orbitrap tandem mass spectrometry

异麦芽寡糖的糖苷键组成及其对消化性的影响，通过孔隙石墨碳色谱-轨道阱串联质谱法分析8种商业样品，发现α-1→6和α-1→4键比例随寡糖链长变化，现有标签标准无法准确反映其消化性和血糖影响，建议制定更精确的标签体系。

　　

林志杰|林孟瑞|周菊华|林佩银|卢廷江

国立台湾大学食品科学与技术研究所，罗斯福路4段1号，台北10617，中国台湾地区

摘要

异麦芽寡糖的消化率和血糖反应受其糖苷键类型和链长的影响。然而，对于四糖以上的糖苷键类型分析仍较为有限。本文采用多孔石墨碳液相色谱-Orbitrap串联质谱技术，对八种商业产品中的二糖至六糖结构进行了分析。结果表明，糖苷键类型主要为α-1→6和α-1→4，且这种类型与链长相关。在二糖中，α-1→4糖苷键占比约为10%，而在六糖中这一比例上升至约80%。在其中一个样品中，α-1→4糖苷键的含量是α-1→6糖苷键的1.6倍。尽管部分产品的异麦芽糖与三糖/九糖含量（干基计）达到或超过90%（符合欧洲食品安全局的标准），但仍有产品未能达到这一要求。这表明需要建立更精确的异麦芽寡糖标签体系，以更全面地反映其消化率和血糖影响。

引言

异麦芽寡糖（IMOs）是一种来自淀粉和其他α-葡聚糖的短链益生元碳水化合物，广泛用作饮料、乳制品和谷物中的膳食纤维添加剂和膨胀剂，以改善食品的质地和功能性（Sorndech, Nakorn, Tongta, & Blennow, 2018）。这些化合物天然存在于基于米饭的发酵食品中（如日本清酒、味噌和酱油，Honda et al., 2021; Tungland & Meyer, 2002），主要通过淀粉的转糖基化反应以不同纯度的糖浆或粉末形式提取。结构上，IMOs是由α-1→6糖苷键连接的葡萄糖单体组成的均聚寡糖，例如异麦芽糖和异麦芽三糖（Goffin et al., 2011; EFSA Panel on Nutrition, Novel Foods and Food Allergens, 2024）。但由于制造工艺的不同，商业IMOs通常包含α-1→2、α-1→3、α-1→4和α-1→6等多种糖苷键；此外，它们的聚合度（DP）范围为2–10，具有线性、分支和环状结构（Goffin et al., 2011; Logtenberg et al., 2021; Sorndech et al., 2018）。

目前，IMOs被分类为膳食纤维或缓释碳水化合物的分类正在重新评估，因为其糖苷键组成——特别是α-1→4与α-1→6的比例——决定了它们在小肠中的水解速率，从而影响血糖反应。黏膜α-葡糖苷酶能更易分解α-1→4糖苷键，而α-1→6糖苷键（尤其是高聚合度的）则相对较难分解（Hu, Winter, & G?nzle, 2020; Lee et al., 2016）。多项成分分析和随机交叉人体试验表明，某些商业IMOs表现为高血糖指数的可消化碳水化合物，其餐后反应与葡萄糖相似（Gourineni, Stewart, Icoz, & Zimmer, 2018; Madsen, Stanley, Swann, & Oswald, 2017）。人类蔗糖酶-异麦芽糖酶复合体可以缓慢地将IMOs完全水解为葡萄糖（Song, Lamothe, Rodriguez, Rose, & Lee, 2022）。这些特异性差异可能导致定量结果偏差。特别是，美国官方分析化学协会（AOAC）推荐的常规酶法-重量法（AOAC 985.29和991.43）依赖于真菌α-葡糖苷酶，该酶对IMOs中的α-1→6糖苷键的催化效率低于哺乳动物α-葡糖苷酶，可能导致IMOs中的膳食纤维含量被高估（AOAC International, 2000a, AOAC International, 2000b; Song et al., 2022）。

从监管角度来看，主要商业IMO成分（VF-DP3-IMO，BioNeutra）已在欧盟被认定为新型食品，在美国被列为安全成分（GRAS）。这些产品的规格主要基于DP3–DP9寡糖含量（欧盟规定还需计入异麦芽糖含量），但两者均未对α-1→6糖苷键的比例设最低要求（EFSA Panel on Nutrition, Novel Foods and Food Allergens, 2024; BioNeutra North America Inc, 2016）。因此，需要采用能精确解析糖苷键类型的分析方法来准确评估IMOs的消化率。

迄今为止，针对DP≥4的IMOs的全面糖苷键分析方法较少。虽然非质谱方法（如高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC–PAD）或亲水相互作用液相色谱-折射率检测（HILIC–RI）可用于分析糖链分布，但这些方法在没有标准品的情况下难以确定糖苷键类型（Madsen et al., 2017; Rengarajan & Palanivel, 2024）。相比之下，串联质谱（MS/MS）可通过特征性的环裂解反应提供结构信息（Domon & Costello, 1988）。Logtenberg等人（2021）使用多孔石墨碳液相色谱（PGC-LC）结合离子阱质谱和核磁共振（NMR）技术鉴定了IMOs中的13种DP3结构，但由于未进行深入的MS/MS分析，DP4–6结构的糖苷键信息仍不完整。

为填补这一知识空白，本研究采用了改进的PGC-LC–Orbitrap-MS/MS方法对DP≥4的商业IMOs进行了全面分析。该方法之前用于半乳寡糖（GOSs）的分析，并能识别β-连接的化合物（Lin, Yang, Lu, Bagal-Kestwal, & Lu, 2022）。其有效性在于Orbitrap质谱仪具备高能量碰撞解离（HCD）功能，能生成关键的环裂解碎片离子，同时分析仪提供高分辨率检测。此外，该方法证明了其重复性和适用于IMOs分析。本研究结果有助于高效控制IMOs的质量，并深入理解其组成与消化率和血糖反应之间的关系。由于不同IMOs和GOS在PGC保留时间上存在差异（α/β构型和单糖组成会影响与石墨的相互作用），该研究为α-连接的葡聚糖提供了有价值的保留时间参考数据库。

化学试剂和标准品

乙腈（≥99.9%，LC-MS级）购自J.T. Baker（美国新泽西州菲利普斯堡）。寡α-1,6-葡糖苷酶（微生物来源）购自Megazyme（爱尔兰布雷）。氨水（25%，LC-MS级）购自Merck（德国达姆施塔特）。超纯水符合I型水标准，由Merck Millipore?系统制备（美国马萨诸塞州伯灵顿）。葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶/过氧化物酶，GOPOD格式）购自Megazyme（爱尔兰布雷）。

以下...

不同来源的IMOs结构分析

通过PGC-LC有效分离了各种IMOs，HCD裂解产生了用于结构鉴定的特征性碎片。图1显示了IMO-QC样品的洗脱谱。在检测到的51种IMOs中（表2和图S1），有40种在糖苷键水平上得到了完全鉴定，包括二糖（11种）、三糖（11种）、四糖（9种）、五糖（4种）和六糖（5种）。由于...

PGC-LC–Orbitrap-MS/MS方法在IMOs分析中的性能

本研究扩展了之前用于β-GOSs的PGC-LC–Orbitrap-MS/MS方法，成功鉴定了40种IMOs结构，其中包括18种DP4–6结构的化合物。实现这一目标的三个关键因素是：（i）使用PGC固定相，具有高异构体分辨能力，能分离不同糖苷键类型的化合物（图1）；（ii）通过高质量分辨率和优化碰撞条件获得HCD产生的环裂解碎片。

结论

本文采用改进的PGC-LC–Orbitrap-MS/MS方法，对八种商业产品中的40种DP2–6 IMOs进行了糖苷键分析，揭示了与其消化率相关的结构特征。这些IMOs主要为二糖和三糖（占比超过50%），同时含有可测量的DP4–6寡糖（23–34%）。其糖苷键类型主要为α-1→6和α-1→4。值得注意的是，α-1→6糖苷键的比例...

术语表

术语	定义
A和X离子	在多糖和寡糖的串联质谱中观察到的环裂解碎片离子。A离子来自非还原端，X离子来自还原端，对于确定糖苷键位置至关重要。术语定义遵循Domon和Costello（1988）提出的系统。
B、C、Y、Z离子	在多糖和寡糖的串联质谱中观察到的碎片离子。

手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在撰写本文时，作者使用了ChatGPT来提高英文文本的流畅性。使用该工具后，作者对内容进行了仔细审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

林志杰：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，数据可视化，方法学研究，概念构思。林孟瑞：方法学研究，概念构思。周菊华：方法学研究，概念构思。林佩银：方法学研究，概念构思。卢廷江：撰写 – 审稿与编辑，项目监督，资金申请，概念构思。

资助

本研究得到了台湾地区国家科学技术委员会的支持[项目编号：MOST 108–2320-B-002-015-MY3]

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国立台湾大学生物资源与农业学院的联合仪器研究中心提供的分析仪器，同时也感谢Editage（www.editage.com）对本文的英文编辑服务。