对Euphausia superba热原肌球蛋白的研究：通过生物信息学和免疫学方法进行表位定位及热稳定性评估

《Food Chemistry》：Investigation of Euphausia superba tropomyosin: Epitope mapping and heat stability assessment via bioinformatics and immunological approaches

结构-活性关系研究揭示高温使磷虾肌球蛋白Eup s 1的IgE/IgG结合能力下降，可能与α螺旋解折叠和氢键网络破坏相关，并确定8个抗原表位中4个对温度敏感。

　　

刘立春|郭伟|张子叶|王浩|李振星|林红

中国海洋大学食品科学与工程学院海洋食品加工与安全控制国家重点实验室，青岛266404，中国

摘要

南极磷虾（Euphausia superba）被认为是最大的海洋蛋白质来源，但由于其致敏性问题，在利用方面存在限制。本研究在分子水平上揭示了南极磷虾原肌球蛋白（Eup s 1）表位与其IgE/IgG结合能力之间的结构-活性关系。研究确定了Eup s 1的八个抗原表位（AA_18–27、AA_55–59、AA_110–125、AA_158–164、AA_215–223、AA_225–239、AA_242–251和AA_258–269）。在低温（20–140?°C）条件下，Eup s 1的二级结构和IgG结合能力相对稳定。然而，在180?°C时，IgE/IgG结合能力下降。圆二色光谱和分子动力学模拟表明，这种下降可能是由于α-螺旋的热诱导展开、氢键网络的破坏以及构象的收缩所致。其中四个表位（AA_18–27、AA_215–223、AA_242–251和AA_258–269）对温度变化更为敏感。该研究为南极磷虾蛋白质的低致敏性加工提供了重要的理论基础。

引言

近年来，由于海洋食品的可持续生产潜力和高营养价值，它们在食品科学和营养学领域引起了广泛关注。其中，南极磷虾被认为是世界上最大的动物蛋白资源（Liu等人，2025年）。目前的生物量估计显示，南极海洋中南极磷虾的存量约为3亿至5亿吨（Li等人，2022年；Liu等人，2025年；Wang等人，2025年），其蛋白质含量高达湿重的11.9–15.4%和干重的60–65%（Li等人，2022年；Liu等人，2025年）。此外，南极磷虾蛋白质的氨基酸组成平衡，生物价值优于牛奶和肉类蛋白质（Li等人，2020年）。值得注意的是，必需氨基酸占总氨基酸组成的40%以上，显示出符合WHO/FAO/UNU标准的优秀营养特性，适用于成人和婴儿（Tang等人，2024年）。在一项为期21天的对照喂养试验中，成年男性的磷虾蛋白净利用率（55%）与全蛋蛋白（61%）之间没有统计学上的显著差异（p?>?0.05）（Taneko & Nobukazu，1990年）。这些发现共同表明，南极磷虾蛋白质具有作为人类营养中陆地蛋白质来源的巨大潜力。然而，甲壳类动物属于八大主要过敏原之一，南极磷虾的过敏风险因素限制了其作为食品加工原料的广泛应用。

当前的研究已经鉴定出甲壳类动物中的多种致敏性蛋白质成分，主要包括原肌球蛋白（TM）、精氨酸激酶、肌浆钙结合蛋白、三磷酸异构酶、血红蛋白、肌球蛋白轻链、原肌球蛋白C、磷酸丙酮酸水解酶、脂肪酸结合蛋白α-肌动蛋白和β-肌动蛋白（Xu等人，2025年；Zhang等人，2023年）。作为高度保守的肌纤维蛋白，TM普遍存在于从软体动物到哺乳动物的肌肉组织中，其表位具有显著的交叉反应性（Han等人，2025年；Martínez等人，2024年）。这种蛋白质具有特征性的α-螺旋棒状构象（分子量284个氨基酸残基），在肌肉收缩过程中起关键作用（Han等人，2025年）。食物过敏流行病学数据显示，TM作为主要过敏原，可在72–98%的甲壳类过敏个体中诱导特异性IgE抗体反应（Chen等人，2025年）。因此，这种蛋白质已成为食品工业中过敏原控制研究的关键目标。目前，已经确定TM是Crangon crangon、Exopalaemon modestus、Litopenaeus vannamei、Macrobrachium rosenbergii、Metapenaeus ensis、Pandalus borealis、Penaeus aztecus、Penaeus indicus、Penaeus monodon等物种的过敏原（Zhang等人，2023年）。通过使用重叠肽库技术，在甲壳类来源的TM蛋白质中鉴定了9个IgE结合表位，覆盖氨基酸残基AA_1~36、AA_37~63、AA_61~81、AA_82~105、AA_115~150、AA_142~162、AA_157~183、AA_190~210和AA_246~284（Ayuso等人，2010年；Zhang等人，2020年；Zhang等人，2023年）。

最近，作者（张子叶、刘立春）将南极磷虾原肌球蛋白作为新的食品过敏原提交给了WHO/IUIS过敏原命名委员会，该蛋白被正式命名为Eup s 1（https://www.allergen.org/viewallergen.php?aid=1184）。然而，Eup s 1表位的分子特性和热稳定性调节机制仍不甚清楚，这严重阻碍了低致敏性水产品加工技术的创新和发展。目前关于Eup s 1热稳定性的研究主要局限于100?°C以下的加热处理（Lin等人，2023年；Wang等人，2022年），而实际加工技术（如烘焙、油炸）通常涉及更高的温度范围。值得注意的是，在高温条件下，Eup s 1的构象不稳定性更加明显，因此系统地研究广泛温度范围内表位和致敏性的动态变化具有科学意义。分子动力学（MD）模拟是一种能够微观尺度上动态追踪蛋白质构象变化的强大工具（Zhu, Liu等人，2025年）。作为实验研究的补充方法，它可以精确表征热处理诱导的Eup s 1表位的构象动态。

在这项工作中，我们假设高温加热会通过改变Eup s 1的构象和影响其表位来改变其IgE/IgG抗体结合能力。首先，通过生物信息学分析系统地表征了Eup s 1的物理化学参数、三级结构特征和表位分布，然后进一步研究了热处理引起的构象转变、免疫反应性的动态变化以及表位可及性之间的相关性。构象演变通过圆二色光谱（CD）、荧光光谱和紫外-可见光谱（UV）等多光谱技术进行表征，而IgE/IgG结合活性通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行定量评估。分子动力学（MD）模拟用于阐明分子水平上的结构-致敏性关系。本研究采用多尺度技术系统分析Eup s 1的物理和化学性质，并结合分子动力学模拟来阐明热变性与致敏性波动之间的相关性，从而为南极磷虾的致敏性控制提供理论工具。

材料

南极磷虾由中国科学院黄海渔业研究所提供。快速SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（15%）购自Epizyme Biotechnology Co. Ltd.（上海，中国）。五个虾类过敏患者的血清来自青岛大学附属医院（青岛，中国），这些患者的临床信息已获得青岛大学附属医院的伦理委员会批准

Eup s 1的提取与鉴定

从南极磷虾肌肉中依次用盐溶液提取Eup s 1，通过等电聚焦沉淀，用硫酸铵分级，然后在SDS-PAGE分析前进行热变性。如图1A所示，SDS-PAGE电泳图显示在35?kDa分子量标记处有一个单一的目标蛋白条带。这一分子量与先前报道的Eup s 1的分子量高度一致（Lin等人，2023年；Wang等人，2022年）。定量

结论

本研究从南极磷虾中提取并鉴定了Eup s 1。通过生物信息学、多光谱技术、ELISA技术和MD分析，在分子水平上揭示了加热温度与Eup s 1结构变化及IgE/IgG结合能力变化之间的关系。在低温处理条件下（60?°C、100?°C和140?°C），Eup s 1的二级结构和IgG结合能力相对稳定。然而，在高温条件下

CRediT作者贡献声明

刘立春：撰写——初稿、可视化、方法学、数据管理、概念化。郭伟：软件、数据管理。张子叶：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理、资金获取。王浩：撰写——审阅与编辑。李振星：撰写——审阅与编辑。林红：撰写——审阅与编辑。

未引用的参考文献

Han等人，2025年

Han等人，2025年

Liu等人，2025年

Liu等人，2025年

Liu, Wang, Cao和Hu，2025年

Suzuki和Shibata，1990年

Wang等人，2022年

Wang等人，2022年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：32572710）的支持。作者感谢中国海洋大学高性能生物计算中心对这项研究的支持。