《Food Control》：Detection of deoxynivalenol, its modified forms, and zearalenone in individual oat grains using visible-near-infrared spectroscopy and near-infrared hyperspectral imaging
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本研究针对燕麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及其修饰形态与玉米赤霉烯酮(ZEN)污染快速检测难题，开发了基于可见-近红外光谱(Vis-NIR)和近红外高光谱成像(NIR-HSI)的单粒谷物分类模型。研究结果表明，NIR-HSI技术在DON、ZEN及DON+ZEN联合检测中分类准确率均超过91%，F1-score高于0.65，且通过筛选20个特征波长即可保持优异性能，为开发多光谱实时分选系统提供了技术支撑，对提升谷物加工安全性和减少食品浪费具有重要意义。
燕麦作为功能性谷物近年来备受关注，其富含的β-葡聚糖被证实具有降低血清胆固醇、促进心血管健康等益处。然而，燕麦与其他小粒谷物一样易受镰刀菌属真菌侵染，特别是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(F. culmorum)，导致脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素的积累。这些毒素对人类和动物健康构成严重威胁：DON作为B型单端孢霉烯族毒素，可引起恶心、呕吐、肠道功能紊乱和免疫抑制；而ZEN因其雌激素活性会干扰激素平衡，影响生殖健康。欧盟为此设定了未加工燕麦中DON和ZEN的最高限量，分别为1,750 μg/kg和100 μg/kg。
更严峻的是，污染问题不仅限于游离形态的毒素。DON的多种修饰形态如3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(DON-3G)也常存在于燕麦中，它们虽未被现行法规直接限制，但具有毒理学意义且在常规分析中易被遗漏。欧盟委员会因此强调，评估健康风险时需综合考虑DON及其修饰形态的总和。值得注意的是，这些修饰形态与DON在天然污染燕麦中呈现强相关性(相关系数通常大于0.90)，而DON与ZEN的共现现象也较常见(相关系数约为0.52)。这意味着高浓度DON的谷物往往同时含有高水平的DON修饰形态，并可能伴有ZEN污染。
燕麦中真菌毒素污染的另一大特征是分布的高度不均匀性。多数谷物洁净或仅轻度污染，但少数谷物却含有极高浓度的毒素。正是这极少数的“害群之马”可能导致整批谷物的平均污染水平超出法规阈值，造成食品浪费和经济损失。若能早在加工链前端识别并剔除这些高度污染的谷物，将显著降低最终食品中的真菌毒素残留，有力保障食品安全和产品质量。
传统的检测方法，如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、侧流层析试纸条法(LFD)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)，通常用于批次样品的真菌毒素分析。然而，这些方法多针对混合样品，可能无法反映单粒谷物的污染情况，且存在成本高、破坏样品、难以适应高通量实时筛查等局限。相比之下，可见-近红外光谱(Vis-NIR)和近红外高光谱成像(NIR-HSI)技术提供了快速、非破坏性的分析方案，并已在谷物真菌毒素检测中展现出潜力。这些技术无需样品制备即可实现对谷物化学和物理特性的表征。与批量筛查不同，光谱技术可应用于单粒谷物水平，分析批次内的光谱变异性，从而识别高度污染的个体单元。单粒近红外分析并非新概念，其研究可追溯至20世纪80年代。通过逐粒分析，光谱方法能够检测到在批量分析中可能被掩盖的极端污染事件，这对于分布高度不均的真菌毒素尤为重要。
仪器设备和数据处理技术的进步已使这一概念走向工业实践。目前已有商用的基于近红外的光学分选机，能够实时每秒分析并分类数千粒谷物。这些系统已应用于谷物加工链，通过选择性剔除缺陷或高度污染的谷物，有效降低了接收部分中的真菌毒素污染。因此，单粒近红外分析成为了连接实验室检测与工业级缓解策略的实用桥梁。
尽管近期研究证明了Vis-NIR和NIR-HSI技术在燕麦样品中检测DON以及T-2和HT-2毒素的可行性，但多数仍聚焦于批量分析。此前有研究利用NIR-HSI对人工接种镰刀菌孢子的燕麦单粒像素进行分类，依据可见损伤比例区分感染等级和DON浓度。亦有研究应用Vis-NIR光谱对人工污染燕麦粒进行T-2和HT-2毒素分类，准确率(CA)达93%。随后，研究将Vis-NIR和NIR-HSI光谱应用于区分天然污染燕麦中T-2和HT-2毒素是否超过法规阈值，报道的最高CA分别为90%和93%。类似策略亦见于其他谷物，如小麦中DON单粒检测准确率可达84%至99%不等。然而，针对天然污染谷物的应用仍然稀缺，尤其是能够同时去除多种毒素的策略。考虑到DON与其衍生物间的强相关性，剔除DON污染谷物也能同步降低DON-3G、3-ADON、15-ADON的含量，并可能减少ZEN。迄今为止，利用Vis-NIR光谱或NIR-HSI技术检测谷物中ZEN和DON修饰形态的研究尚未见报道。开发此类方法有望通过降低误拒洁净批次或误收污染批次的风险，成为高效的风险缓解策略，从而在提升食品安全和法规符合性的同时，通过减少食品损失和批次拒收带来的经济负担，提高燕麦生产的经济效益和可持续性。
工业应用开发需要简化模型。全光谱模型计算密集，不适用于实时分选系统。通过识别并筛选有限数量的信息波长，可以开发出更快速、更稳健且易于集成到自动化谷物加工线的多光谱模型。
因此，本研究旨在评估Vis-NIR和NIR-HSI光谱技术在检测单粒燕麦中DON及其修饰形态(DON-3G、3-ADON、15-ADON)以及ZEN污染的潜力，并以LC-MS/MS作为参考方法。这些燕麦样品均来自DON水平超过欧盟限量的批次。具体目标包括：开发能够识别超过欧盟DON和/或ZEN限量的谷物的分类模型；探索与污染相关的光谱特征；以及通过波长选择降低模型复杂度。
本研究采用了几个关键技术方法。首先，样本来源于2021年瑞典西约特兰地区采集的两个DON高污染白色未加工燕麦样品。其次，核心检测技术包括近红外高光谱成像(NIR-HSI)和可见-近红外光谱(Vis-NIR)。NIR-HSI系统使用推扫式高光谱成像系统（Resonon Pika NIR-320相机），光谱范围900-1700 nm，分辨率4.6-4.7 nm。Vis-NIR使用LabSpec 2500近红外分析仪，光谱范围350-2500 nm。对200粒单粒燕麦（每样品100粒）分别进行三种取向（正面朝上、正面朝下、随机）扫描，各获得600条光谱。第三，真菌毒素定量采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，对每粒谷物单独进行DON、DON-3G、15-ADON、3-ADON和ZEN的提取和分析，方法经验证符合欧盟法规要求。第四，数据处理与分析方面，将毒素浓度转换为二元类别（高于或低于欧盟限量），采用软投票集成分类器（结合逻辑回归和偏最小二乘(PLS)回归），并利用10折分层交叉验证评估模型性能。通过置换重要性分析筛选最具信息量的波长，并构建多光谱模型（使用前20、10、5个波长）以评估简化可行性。
3.1. 不同DON和ZEN水平燕麦粒的光谱谱图比较
通过比较高于和低于欧盟法规限量的燕麦粒平均光谱反射率 profiles 发现，尽管差异细微但确实存在。在NIR-HSI光谱中，DON含量较低的谷物在1000-1200 nm范围内反射率略低，而在1400 nm以上则表现出更高的反射率。Vis-NIR光谱在整个谱区内重叠较多，但在800-1400 nm和1600-1900 nm区域，污染较轻的谷物反射率略低。对于ZEN，NIR-HSI光谱中高ZEN谷物初始反射率增加，随后趋于一致，1400 nm后反射率略低。Vis-NIR光谱在380-800 nm可见光区，高ZEN谷物反射率较低，提示表面颜色可能存在细微变化；在900-1400 nm近红外区，污染较重谷物反射率较强；而在1900-2500 nm区，低ZEN谷物反射率更高。这些差异主要出现在与水分、蛋白质、淀粉等化学成分吸收相关的区域，表明镰刀菌侵染和毒素产生引起了谷物化学和物理变化，为使用化学计量学方法区分污染谷物提供了依据。
3.2. 谷物重量分布及其与真菌毒素污染的关系
200粒燕麦谷物的重量分布在20.1至56.8 mg之间，平均41.9 mg，显示出自然的异质性。谷物重量与所有分析的真菌毒素浓度均呈弱负相关（Pearson相关系数：DON为-0.106，DON-3G为-0.113，15-ADON为-0.079，3-ADON为-0.077，ZEN为-0.136）。虽然相关性不强，但表明污染水平较高的谷物倾向于更轻。与未污染谷物相比，污染谷物的平均重量轻微降低（平均减少3.9%），这与先前关于镰刀菌感染导致燕麦粒重量适度降低的报道一致。
3.3. 谷物水平分选对降低燕麦批次真菌毒素含量的潜在影响
对200粒燕麦的单粒真菌毒素含量分析揭示了高度不均匀的分布。大多数谷物毒素含量低或未检出，但少数谷物含有一种或多种毒素的极高浓度。模拟计算表明，仅剔除DON含量超过1,750 μg/kg的谷物，即可使剩余批次中DON平均浓度降低89.3%（从4,507降至482 μg/kg），同时DON-3G、15-ADON、3-ADON和ZEN浓度也显著下降（分别降低98.0%、95.2%、95.5%和54.0%）。仅剔除ZEN超标谷物对ZEN的降低幅度较温和（-45.5%），但对DON及其衍生物也有明显降低效果（DON降低57.8%）。同时应用DON和ZEN阈值的联合策略，在有效降低DON及其衍生物（效果与DON单独策略相近）的同时，对ZEN的降低效果（-67.0%）优于单独ZEN策略。这证实了少数高度污染谷物对批次污染负荷的关键作用，靶向剔除策略能大幅降低整体污染。
3.4. 依据欧盟DON限量对单粒燕麦进行分类
NIR-HSI技术在DON分类上表现优异，最佳预处理方法（SNV结合一阶导数或反之）的分类准确率(CA)达94±4%和92±8%，F1-score分别为0.68±0.12和0.68±0.14，曲线下面积(AUC)为0.89-0.90。而Vis-NIR技术表现较差，最佳CA为91±5%，但F1-score较低（0.44-0.48），AUC（0.60-0.75）表明区分能力中等。NIR-HSI的优势在于其能捕获每粒谷物数百个像素的光谱信息，进行空间平均，更全面地反映谷物状况；而Vis-NIR依赖单点接触光谱，对局部变异、谷物取向和表面接触效应更敏感。最具信息量的波长集中在1000-1250 nm和1300-1500 nm的NIR区域，以及与可见光区400-465 nm相关的波长。这些区域与镰刀菌侵染引起的蛋白质、纤维、β-葡聚糖、谷壳结构和颜色特征等间接变化相关。
3.5. 依据欧盟ZEN限量对单粒燕麦进行分类
NIR-HSI对ZEN的分类结果非常出色，最佳模型（SNV以及一阶导数+SNV）的CA高达99±1%，F1-score分别为0.89±0.14和0.90±0.16，AUC为0.97。Vis-NIR的最佳CA约为93%，F1-score为0.68-0.70，AUC为0.89-0.91，性能明显低于NIR-HSI。ZEN分类性能普遍高于DON，可能意味着ZEN污染引起了更显著和/或更一致的生化物理变化。相关波长与DON分类模型选出的波长高度重叠，再次支持了光谱检测基于真菌侵染间接效应的观点。
3.6. 对同时超过DON和ZEN欧盟限量的单粒燕麦进行分类
联合DON+ZEN分类模型性能与单独DON模型相近。NIR-HSI最佳模型CA为93±4%和93±3%，F1-score为0.64-0.66，AUC约0.89。Vis-NIR最佳CA为91-92%，F1-score为0.47-0.51。联合模型的关键波长仍落在之前确定的与镰刀菌相关的光谱区域内。此策略提供了单一决策步骤同时筛查多种毒素的实用方案，模拟显示能有效降低多种毒素水平，且不增加计算负担，适于工业高通量分选系统。
3.7. 多光谱分类模型
将光谱输入减少到筛选出的20个特征波长后，NIR-HSI模型的分类性能得以保持甚至略有提升（例如DON分类CA达94-95%），证明了多光谱实施的可行性。然而，波长减少对Vis-NIR模型性能产生明显负面影响，CA和F1-score下降，变异性增加。这表明NIR-HSI的空间平均特性使其对波长简化更具鲁棒性，而Vis-NIR的点测量则更依赖全光谱信息来补偿局部变异性。从计算效率看，波长简化对推理时间影响不大，但显著降低了数据维度和硬件复杂性，更有利于工业实时分选应用。
本研究证实了光谱技术可用于单粒燕麦中DON、其修饰形态及ZEN污染的有效检测。NIR-HSI性能显著优于Vis-NIR，尤其在应用适当光谱预处理后。最有效的光谱信息 consistently 位于1000-1250 nm和1300-1500 nm的NIR区域，这些区域与镰刀菌侵染引起的间接生化结构变化（如谷壳结构、蛋白质组成、纤维含量变化）相关，而非毒素直接吸收。结合DON和ZEN检测的模型提供了同时去除多种污染谷物的实用方案。应用此模型可大幅降低毒素总浓度，特别是DON及其修饰形态。从应用角度看，选择性剔除少量高度污染谷物（它们是批次不合格的主因）的策略优势明显。此类靶向筛查能避免整批燕麦的不必要废弃，从而在提升食品安全和法规符合性的同时，改善谷物加工链的可持续性和经济性。未来研究需解决当前类别不平衡问题，并扩充包含更广污染水平（尤其是天然高污染）谷物的数据集，以进一步增强模型的鲁棒性和普适性。总体而言，基于NIR-HSI的多光谱检测技术为开发实时、高效的谷物安全控制方案奠定了坚实基础，对保障食品安全、减少浪费具有重要意义。
