《Food Chemistry》：Influence of plant age and sunlight exposure on the volatile profile and metabolomic pathways of
Ilex guayusa leaves used in the traditional Amazonian beverage
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本研究通过GC-EI-MS代谢组学分析发现，Ilex guayusa叶片中挥发物及低分子量代谢物含量受年龄和光照显著影响，4-6岁植物含较高香草醛、十六烷酸，6-8岁含苯乙醛、咖啡酸，8-10岁含吡咯烷酮等，光照促进酚类物质积累而遮阴增强脂类成分，代谢通路分析揭示了年龄与光照对降解物、苯丙烷代谢及脂肪酸降解的影响，为开发天然活性成分产品提供依据。
杰斐逊·V·帕斯图尼亚-法索（Jefferson V. Pastu?a-Fasso）|梅兰妮·奥乔亚-奥坎波（Melanie Ochoa-Ocampo）|托马斯·加尔松（Thomas Garzón）|埃迪森·冈萨雷斯（Edison Gonzales）|尼娜·埃斯皮诺萨·德洛斯蒙特罗斯-席尔瓦（Nina Espinosa de los Monteros-Silva）|祖莱·尼尼奥-鲁伊斯（Zulay Ni?o-Ruíz）|卡雷尔·迪格斯-桑塔纳（Karel Dieguez-Santana）|诺罗斯卡·G.S. 莫戈隆（Noroska G.S. Mogollón）
生物分子发现小组，阿马索尼亚地区大学Ikiam分校，Km 7 Via Muyuna，特纳（Tena），纳波（Napo），厄瓜多尔
摘要
采用GC-EI-MS对水提取物进行了非靶向代谢组学分析，并通过四种自由解卷积工具（MZmine、MS-DIAL、“eRah”和MSHub/GNPS）进行了代谢物鉴定。共鉴定出205种代谢物，并给出了三个置信度等级。年龄特定的代谢物丰度显示：4-6岁植物中的香草醛、十六烷、氢醌等物质含量显著较高；6-8岁植物中的苯乙醛、2-氨基酚、二氢-3-氧-β-伊醇和棕榈酸含量较高；8-10岁植物中的[5,5-二甲基吡咯烷-2-酮]、环烯和甲基儿茶酚含量较高。在光照条件下，4-丙烯基丁香酚、儿茶酚和丁香酚等酚类化合物在光照下的含量显著增加，而1-十六醇、1-十四醇和植醇等脂类化合物在遮荫植物中更为丰富。代谢途径分析表明，植物年龄和光照条件显著影响了参与污染物降解、苯丙素生物合成、酪氨酸代谢和脂肪酸降解的代谢物。这些发现为了解I. guayusa的生化可塑性及其开发富含特定生物活性化合物的天然产物的潜力提供了新的见解。
引言
Ilex guayusa（洛斯，Ilex guayusa）是一种属于冬青科（Aquifoliaceae）的多年生灌木，是安第斯-亚马逊地区的特有物种，分布于哥伦比亚、厄瓜多尔和秘鲁之间，海拔200–2600米地区（Due?as等人，2016年）。长期以来，基奇瓦人（Kichwa）、舒阿尔人（Shuar）等原住民群体使用其叶子制作刺激性的饮料，用于仪式和日常用途，包括在夜间狩猎时保持清醒、缓解阿亚瓦斯卡（ayahuasca）的苦味和后效以及缓解一般不适（Chianese等人，2019年）。近年来，这些传统用途激发了大量研究，报道了I. guayusa提取物和饮料具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病和低细胞毒性作用，突显了其在营养保健品、药理学和生物医学应用中的潜力（Ochoa-Ocampo等人，2025年）。然而，尽管兴趣日益增加，但对于其代谢组（尤其是挥发性和低分子量化合物）如何随植物年龄和环境条件（如光照）变化知之甚少，而这些因素是决定产品质量和功能的关键。
在这种情况下，I. guayusa的生物活性预计与其次级代谢物密切相关，如酚类化合物、生物碱和萜类化合物，它们在植物防御和对生物和非生物胁迫的响应中起着重要作用（Divekar等人，2022年；Kapadia等人，2022年）。因此，了解这些代谢物的变化不仅对生态学具有重要意义，而且对于确保植物衍生产品的质量和一致性也至关重要。代谢组学的进步现在能够对复杂的植物基质进行高分辨率表征，并为药物相关物种提供所需的分析精度，其中代谢物组成的变化直接影响生物活性（Dhifi等人，2016年；Kapadia等人，2022年）。特别是非靶向代谢组学方法能够同时检测多种化学类别，并揭示与环境或发育线索相关的补偿性生物合成模式或微妙变化（Zhang等人，2014年）。然而，代谢物的积累受到发育因素（如叶片年龄、发育阶段）和环境条件（如光照、养分可用性或水分状况）的强烈调节，这些因素共同调控代谢途径（Hong等人，2016年）。例如，在Camellia sinensis中，高光照强度会降低咖啡因含量但增加茶氨酸含量，因为氮会重新分配以进行光保护（Zhang等人，2014年）。在Ilex paraguariensis中，暴露在阳光下的叶片积累的生物活性代谢物比遮荫叶片更多，尽管遮荫会增强绿原酸的合成（Dartora等人，2011年）。然而，在该物种中未观察到与年龄相关的差异，这表明即使在相关分类群中，发育响应也可能有所不同（de Aguiar等人，2024年）。
在I. guayusa中，次级代谢物的生物合成和积累受到环境（如光照强度和土壤性质）和发育（如植物年龄）因素的复杂相互作用的影响（Fernández等人，2025年）。据报道，成熟植物（>8岁）的叶子含有高达40%更多的总酚类化合物和更高的抗氧化活性（Fernández等人，2025年；Villacís-Chiriboga等人，2018年）。此外，大多数研究集中在咖啡因和绿原酸等代谢物上，限制了关于少量化合物（如倍半萜和特殊生物碱，例如可可碱）的信息，这些化合物的生态作用和药理应用尚未得到充分探索（Negrin等人，2019年）。因此，仍存在一个明显的知识空白：尚未有全面的代谢组学研究评估植物年龄和光照如何共同影响I. guayusa的挥发组和小分子量代谢谱，尤其是在传统上作为饮料饮用的水提取物中。这一空白尤为重要，因为水基提取物中挥发性和半挥发性化合物的代谢组行为尚未得到充分研究，尽管这种提取类型最直接影响感官特性、生物活性和消费者体验。解决这一限制对于理解该物种的代谢可塑性以及制定旨在提高产品质量和生物活性潜力的农艺和管理实践至关重要。因此，选择了GC–EI-MS作为分析平台，因为它可以访问广泛的光谱库，并能够对水中提取的挥发性和半挥发性化合物进行高置信度鉴定。此外，顶空分析可以检测更广泛的挥发性和半挥发性化合物，而不受纤维的影响，从而获得更能代表实际释放代谢物的谱型。虽然LC–HRMS更适合分析非挥发性酚类化合物，但超出了本研究的范围，本研究专注于水提取物中可检测的挥发组和低分子量代谢物。由于化学变化本身仅提供系统的描述性视图，因此需要通过研究这些代谢物在生物途径中的映射来对其进行功能解释。因此，途径水平分析是植物代谢组学的重要组成部分，因为它将观察到的化学变化与潜在的生物合成或降解途径联系起来。在复杂的农林系统中栽培的物种中，这种综合视角尤为重要，因为代谢可能受到环境条件和发育阶段的相互作用的影响。因此，结合途径分析可以为解释代谢变化提供更全面的机制背景，并支持对I. guayusa的功能化学的更全面理解。还需要注意的是，来自KEGG数据库的途径注释有时可能会将代谢物映射到通常与微生物异生物质降解相关的途径上。这并不意味着植物本身存在这些途径，而是反映了叶圈和内生微生物可以贡献在非靶向分析中可检测的代谢物。
因此，本研究旨在：（i）表征不同年龄组I. guayusa的挥发组和低分子量代谢谱；（ii）确定光照对这些化学类别的影响；（iii）整合途径水平信息以识别受这些因素影响的代谢途径。基于相关物种的先前证据，我们假设在较高光照条件下，酚类衍生物和其他苯类化合物会因光保护作用而增加，而在遮荫条件下，脂类和脂肪酸衍生的代谢物会更加丰富。我们进一步预期苯丙素和生物碱相关途径会随年龄发生变化，反映了次级代谢的发育调控。测试这些假设为解释I. guayusa化学成分的环境和发育变化的功能后果提供了框架。
实验设计和植物材料
实施了如补充表A1中详细描述的混合水平因子实验设计。设计包括三个因素：地理位置、植物年龄和光照条件。地理位置因素包括三个地点或水平（Alto Pano、Alto Tena和Talag）；年龄在三个阶段进行评估（早期、中期和晚期）；光照条件在两个水平上进行评估（遮荫和光照）。
代谢组学谱型
在Ilex guayusa叶片的水提取物中鉴定出205种代谢物，分为三个鉴定置信度等级：第1级14种代谢物，第2级66种，第3级125种。第1级的鉴定是通过将解卷积后的MS/MS碎片模式和保留指数（RI）与真实参考标准进行匹配来实现的。相比之下，第2级的鉴定基于光谱相似性和与光谱条目的RI比较。
代谢组学谱型
先前的研究发现环境因素会改变特定植物次级代谢物的积累（Fernández等人，2025年；Karimi等人，2020年）。我们发现地理位置因素会影响I. guayusa叶片的挥发性成分（图2C）。因此，这一结果表明，除了光照之外，还有其他环境因素（如海拔、土壤条件、降水量和温度）也可能影响I. guayusa叶片的化学谱型。
结论
本研究表明，植物年龄（4-6岁、6-8岁和8-10岁）和光照条件（遮荫0-300 μmol m?2 s?1 和光照 >300 μmol m?2 s?1）显著影响Ilex guayusa叶片中某些代谢物的相对丰度。除非找到每个年龄段的特定代谢物，否则在光照因素中观察到了显著的模式：在光照条件下，酚类化合物的丰度较高；而在遮荫条件下，脂类化合物更为丰富。
CRediT作者贡献声明
杰斐逊·V·帕斯图尼亚-法索（Jefferson V. Pastu?a-Fasso）：撰写——原始草稿、方法学、数据管理。梅兰妮·奥乔亚-奥坎波（Melanie Ochoa-Ocampo）：验证、方法学。托马斯·加尔松（Thomas Garzón）：软件、方法学、数据管理。埃迪森·冈萨雷斯（Edison Gonzales）：数据管理。尼娜·埃斯皮诺萨·德洛斯蒙特罗斯-席尔瓦（Nina Espinosa de los Monteros-Silva）：可视化、监督、方法学。祖莱·尼尼奥-鲁伊斯（Zulay Ni?o-Ruíz）：资源、项目管理、资金获取。卡雷尔·迪格斯-桑塔纳（Karel Dieguez-Santana）：撰写——审稿与编辑、验证。诺罗斯卡·G.S. 莫戈隆（Noroska G.S. Mogollón）：撰写——审稿与编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
