《Food Hydrocolloids》：Structural transitions and emulsification properties of pH-shift soy protein amyloid fibrils
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本研究针对传统Pickering乳液稳定性不足的问题，开发了樱桃秸秆纤维素纳米晶（CS-CNC）/乳清蛋白（WP）复合物作为新型稳定剂，并通过负载花青素（AN）提升其抗氧化性能。研究发现，在pH 4.0条件下形成的CS-CNC/WP（1:4）复合物具有最佳界面活性和乳化稳定性，乳液液滴分布均匀且储存28天无相分离。意外的是，AN在酸性环境中表现出促氧化作用，加速了脂质氧化。该研究为果蔬副产物高值化利用和食品乳液稳定性设计提供了新思路。
在现代食品工业中，乳液体系广泛应用于饮料、酱料和功能性食品等领域。然而，传统乳液存在物理不稳定和易氧化等问题，制约了产品质量和货架期。Pickering乳液（Pickering Emulsions, PEs）作为一种由固体颗粒稳定的乳液体系，因其独特的界面稳定机制受到广泛关注。纤维素纳米晶（Cellulose Nanocrystals, CNCs）作为一种天然、可生物降解的纳米材料，被认为是极具潜力的Pickering乳液稳定剂。但CNCs表面富含羟基，亲水性强，与疏水性油脂的相互作用较弱，限制了其乳化效果。此外，脂质氧化是影响乳液化学稳定性的关键因素，通常从油水界面开始，因此界面处的抗氧化保护至关重要。
为了克服这些挑战，研究人员尝试对CNCs进行表面修饰。化学修饰虽能引入疏水基团，但可能引入有毒试剂，存在食品安全隐患。与之相比，蛋白质修饰作为一种安全、环保的替代方案，因其能降低界面张力、在液滴周围形成弹性层以及良好的生物相容性而受到青睐。同时，将具有抗氧化活性的多酚类物质（如花青素 Anthocyanins, ANs）引入蛋白质-CNCs复合体系，有望在界面处提供抗氧化保护，进一步提升乳液的氧化稳定性。然而，花青素的稳定性高度依赖于环境pH，其在酸性条件下最为稳定，但此前相关研究多在近中性或碱性条件下进行，这可能影响了其抗氧化效能的发挥。更有趣的是，一些强效抗氧化多酚在特定条件下（如酸性环境、存在金属离子时）可能表现出促氧化（Prooxidant）行为。因此，探索CNC、蛋白质和ANs三者复合体系在Pickering乳液中的应用，特别是其在酸性条件下的界面行为和氧化稳定性，具有重要的科学意义和实际应用价值。
在此背景下，来自德国基尔大学（Kiel University）的Eda Yildiz和Zeynep Altintas在《Food Hydrocolloids》上发表了一项研究，他们利用樱桃加工副产物——樱桃秸秆和樱桃果渣，分别作为CNCs和ANs的可持续来源，开发了一种新型的CS-CNC/WP/AN复合物，并系统研究了其作为Pickering乳液稳定剂的物理稳定性和对脂质氧化的影响。
本研究的关键技术方法主要包括：从樱桃秸秆中通过碱处理、漂白和酸水解提取CS-CNCs，并从樱桃果渣中采用酸醇法提取ANs；通过调节pH和超声处理制备不同质量比的CS-CNC/WP复合物及AN负载复合物；利用动态光散射（DLS）测定粒径和Zeta电位，荧光光谱和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析分子间相互作用，接触角测量评估表面润湿性；制备O/W型Pickering乳液并评估其长期储存的物理稳定性（微观结构观察、粒径分析）和化学稳定性（通过测定脂质氢过氧化物含量评估氧化程度）。
3.1. Characterization of CS-CNC
研究人员首先对从樱桃秸秆中分离的CS-CNC进行了详细表征。荧光显微镜（FLM）和扫描电子显微镜（SEM）图像显示，经过碱处理（CS-A）和漂白处理（CS-B）后，纤维束尺寸显著减小，杂质被有效去除，为后续酸水解制备纳米晶奠定了基础。透射电子显微镜（TEM）显示CS-CNCs呈近球形形态，平均粒径约为160 nm，纵横比约为1.15，这与通常报道的针状CNCs不同。动态光散射（DLS）测得的平均流体动力学直径约为269 nm。Zeta电位为-42.74 mV，表明CS-CNC悬浮液具有优异的胶体稳定性，这归因于酸水解引入的硫酸根（-OSO3-）基团。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了半纤维素和木质素等杂质的成功去除，X射线衍射（XRD）分析显示CS-CNC的结晶度指数（Crystallinity Index, CrI）为58.5%，属于典型的纤维素Iβ晶型。
3.2. Characterization of formed CS-CNC/WP complex
研究人员接着研究了CS-CNC与WP复合物的形成与性质。Zeta电位随pH变化曲线表明，WP的等电点（pI）在4.0到5.0之间。在pH 4.0时，WP带正电，而CS-CNC带负电，二者通过静电相互作用成功形成复合物。随着WP比例的增加（从1:1到1:4），复合物的粒径增大（从602 nm到684.9 nm），Zeta电位绝对值略有降低，但仍低于-20 mV，表明复合物具有良好的胶体稳定性。视觉观察显示所有CS-CNC/WP复合物在4周储存期内均保持均一，无相分离。接触角测量表明，随着WP的加入，复合物的疏水性显著增强，CS-CNC/WP4的接触角达到50.9°，远高于纯CS-CNC的25.5°，这有利于其在油水界面的吸附。荧光光谱显示，与WP结合后，色氨酸残基的荧光强度显著降低（荧光猝灭），表明CS-CNC与WP发生了相互作用。FTIR光谱中O-H和N-H伸缩振动峰的位移也证实了CS-CNC与WP之间存在氢键和静电相互作用。对WP二级结构的分析表明，CS-CNC的加入使WP的分子间β-折叠含量增加，促进了更有序的蛋白质结构。
3.3. Formation and characterization of AN-loaded CS-CNC/WP4 complex
基于上述结果，研究人员选择了CS-CNC/WP4复合物进行AN的负载。DPPH自由基清除实验表明，樱桃果渣提取物的AN含量为121.91 mg L-1，其抗氧化活性（AA）为61.30%，而CS-CNC/WP4/AN复合物的AA进一步提高到65.82%，表明AN与WP的复合增强了整体的抗氧化能力。荧光光谱显示，AN的加入导致WP的荧光强度进一步降低，且最大发射波长发生红移（从340 nm到351 nm），表明AN与WP的色氨酸残基发生了相互作用，并改变了其微环境的极性。接触角测量显示，负载AN后，复合物的接触角略微下降至45.8°，疏水性略有降低，这可能与AN分子富含羟基增加亲水性有关。FTIR光谱中氢键相关吸收峰的加宽进一步证实了AN通过氢键等非共价相互作用整合到复合物中。CS-CNC/WP4/AN复合物的Zeta电位为-19.95 mV，接近胶体稳定性的临界值。
3.4. Effect of CS-CNC and AN-loaded CS-CNC/WP4 complexes on PE stability
最后，研究人员评估了这些复合物作为Pickering乳液稳定剂的效果。3.4.1. Physical stability 结果显示，单独使用WP或CS-CNC均无法形成稳定的乳液，很快出现相分离。而由CS-CNC/WP4和CS-CNC/WP4/AN稳定的乳液在28天储存期内均保持了物理稳定性，无明显的相分离或乳析现象。乳液液滴的初始粒径分别为3.32 μm和4.15 μm，在储存期间粒径逐渐增大，但分布相对均匀，表明复合物在液滴界面形成了有效的保护层。流变学测试表明，两种乳液均表现出典型的剪切变稀行为，较高的初始粘度有助于乳液的静态稳定。荧光显微镜图像清晰显示，CS-CNC/WP复合物（蓝色荧光）和ANs（红色荧光）分布在乳液液滴的界面和连续相中，证实了复合物在界面的吸附。3.4.2. Emulsion oxidative stability 令人意外的是，在28天的储存期间，虽然CS-CNC/WP4稳定的乳液也发生了脂质氧化（过氧化值PV增加），但负载了AN的CS-CNC/WP4/AN稳定的乳液其PV增长更为显著和快速。这表明在本研究采用的酸性（pH 4.0）条件下，ANs非但没有起到预期的抗氧化作用，反而表现出促氧化活性，加速了乳液的脂质氧化。研究人员分析，这可能是由于在酸性环境中，ANs与体系中可能存在的过渡金属离子（如Fe、Cu）形成络合物，促进了氧化还原循环，从而产生了促氧化效应。
本研究成功地从樱桃加工副产物中开发出一种新型的CS-CNC/WP/AN三元复合物，并将其应用于Pickering乳液的稳定。研究证实，CS-CNC与WP在pH 4.0条件下通过静电相互作用形成的复合物能显著提高界面活性和乳化能力，赋予乳液优异的物理稳定性。然而，一个关键且有趣的发现是，在酸性乳液体系中，负载的ANs表现出促氧化而非抗氧化的行为。这一发现深刻揭示了多酚类抗氧化剂在复杂食品体系中的双重角色（抗氧化/促氧化）强烈依赖于其局部微环境（如pH、金属离子等）。该研究不仅为利用农业副产物开发可持续的食品乳液稳定剂提供了新策略，也提醒我们在设计功能性食品体系时，需要充分考虑活性成分的化学状态、定位以及与其他组分的相互作用。未来研究可进一步探讨不同AN浓度、pH条件、金属离子种类和浓度对三元复合物行为和功能的影响，并利用更精密的分析技术（如高效液相色谱HPLC表征AN组成，电子顺磁共振EPR研究自由基过程，分子对接模拟相互作用，石英晶体微天平QCM分析界面吸附）来深入揭示其内在机制。
