结合超声技术的生物制造方法，用于制备排列整齐的鱼类肌肉组织

《Food Research International》：Ultrasound-integrated biofabrication of aligned piscine muscle tissue

通过超声辅助3D生物打印技术实现鱼类卫星细胞的高效定向排列和肌肉纤维再生，激活Piezo1通道与ERK5信号通路提升细胞增殖率与组织成熟度。

　　

牛瑞豪|徐恩波|邓勇|陈启和|陈俊|刘东红

浙江大学生物系统工程与食品科学学院，智能食品技术与设备国家地方联合工程实验室，浙江省农业食品加工重点实验室，富里食品科学研究所，杭州310058，中国

摘要

高度成熟的肌纤维的方向性排列是体外肌肉组织再生成功的关键标志，无论是在再生医学还是培养肉制品中都是如此。虽然3D生物打印能够精确制造组织结构，但它本身缺乏控制生物墨水中嵌入的细胞的空间分布和生长轨迹的能力。在这里，我们将超声波与3D生物打印结合使用，利用其精确控制能力来工程化高度排列的细胞组织并诱导肌纤维的形成。计算模拟和实验验证都表明，暴露于4000 kHz的超声波频率能够产生明显的细胞排列，并伴随着增殖率的提高。间歇性低强度超声波（LIUS）刺激有效地激活了鱼类卫星细胞（PSCs）中的机械敏感Piezo1通道，促进了Ca²⁺的流入。Ca²⁺激活下游MAPK途径中的ERK5，从而上调Myogenin和MHC的表达，最终促进PSCs分化并融合成肌管。这种非侵入性的超声波物理刺激方法在构建可食用肌肉组织方面具有巨大潜力。

引言

海洋渔业资源是自然资源的重要组成部分，是全球人类消费动物蛋白的主要来源。它们为世界上近三分之二的人口提供了大约40%的蛋白质（Bi, Zhang, Guo, & Wan, 2023）。虽然水产养殖可以在一定程度上缓解对海产品的需求，但其工业化、高密度的养殖方式同时也导致了严重的环境污染和生态退化（Drizo & Shaikh, 2023）。细胞培养肉技术代表了一种创新的方法，利用组织工程技术从体外培养的动物细胞生产模拟肉制品（Lee et al., 2023; Post, 2014）。与传统畜牧业生产肉类相比，细胞培养肉简化了从整个动物到细胞层面的过程。这种方法在动物福利、环境保护、能源利用效率和资源可持续性方面具有明显优势（Gaydhane, Mahanta, Sharma, Khandelwal, & Ramakrishna, 2018）。然而，仍然存在重大挑战。作为可持续海产品生产的有希望的途径，培养鱼类肉在复制天然肌肉组织的排列微结构方面面临重大技术障碍，这对其质地真实性至关重要。

体外组织再生从根本上依赖于细胞在三维（3D）支架中的增殖和分化，最终形成具有特定结构组织和功能的生物组织。生物3D打印通过精确逐层沉积包含活细胞和生物活性成分等关键成分的生物相容性材料来满足这一需求，这些过程受到目标生物组织的形态和功能规格的指导（Guan, Zhou, Du, & Chen, 2022）。具体来说，这项技术能够实现复杂3D生物结构的个性化制造。因此，生物3D打印被广泛认为是构建可行、功能性体外组织架构的最有前途的方法（Derakhshanfar et al., 2018; Liu et al., 2020）。然而，这项技术的一个根本性限制在于它无法在制造过程中有效协调生物墨水中嵌入的细胞的空间配置（排列）和生长轨迹。

肌细胞是肌肉组织中的主要细胞类型，它们通过其空间排列对组织的机械/质地特性产生关键影响。目前实现支架上定向细胞生长的方法主要依赖于外部机械刺激（Han, Gomez, Duda, Ivanovski, & Poh, 2023）。磁场/电场方法需要磁性或导电微粒，这可能导致细胞损伤和不可食用性（Ahadian et al., 2012）。声学操控（利用声波/驻波）能够实现颗粒或细胞的直接、微米级精确图案化（Guex, Di Marzio, Eglin, Alini, & Serra, 2021; Yang et al., 2022）。然而，声压节点的固有周期性线性/平面分布将细胞主要限制在二维平面上，阻碍了复杂空间梯度的形成。Chansoria等人（Chansoria, Narayanan, Schuchard, & Shirwaiker, 2019）使用带有侧向压电陶瓷的定制模具制造了条纹状的3D细胞排列。尽管如此，将超声波的微米级操控与3D打印的空间定制相结合仍是一个关键的研究挑战。

对于可食用肌肉组织的形成，肌母细胞分化为肌纤维的效率是肌肉成熟度的一个关键指标（Chal & Pourquié, 2017）。诱导肌肉干细胞分化的常用方法主要包括化学因子调节和物理刺激（Messmer et al., 2022; Tsimbouri et al., 2017）。化学调节利用小分子化合物抑制异常表达的信号通路，从而增强肌肉卫星细胞中肌生成调节因子的表达（Kwon, 2025）。鉴于食品安全要求，将化学因子纳入细胞培养肉中需要严格的审查。在肌肉发育过程中，机械信号是骨骼肌形成和再生的重要外部信号（Jones, Penney, & Theodossiou, 2023）。超声波诱导的机械应力能够增强机械敏感的细胞内途径的表达，提高细胞分化潜力，并在软骨修复等医学领域得到应用（Lee, Choi, Min, Son, & Park, 2006; Yi, Liu, Cheng, & Zhou, 2021）。值得注意的是，超声波处理具有非侵入性和高生物相容性，在细胞培养肉生产中具有巨大潜力。

我们之前的研究使用了葡聚糖纳米粒子增强的支架来促进鱼类卫星细胞（PSCs）的高密度生长（Niu et al., 2025）。然而，与食品安全生产原则相一致的有效细胞排列和肌生成分化控制策略仍然缺乏。在这项研究中，我们开发了一种新的两步超声波策略来诱导PSCs形成排列整齐的肌纤维。首先，使用声流控3D打印喷嘴将含有PSCs的支架材料挤出。随后，结合血清限制施加低强度超声波刺激（LIUS）以促进肌生成分化。LIUS处理通过激活机械敏感的Piezo1离子通道来触发Ca²⁺的流入。Ca²⁺的激增随后激活下游MAPK信号途径中的ERK5蛋白，最终促进肌生成因子的表达，并促进细胞分化并融合成多核肌管。

材料与化学品

鱼类卫星细胞（PSCs）取自大黄鱼（Larimichthys crocea），方法参照了我们之前的研究（Xu et al., 2023）。普通玉米淀粉由Karl Golden（中国杭州）提供，明胶和海藻酸钠从Yuanye（中国上海）购买，其他化学品和试剂从Sigma-Aldrich（中国上海）购买。

生物墨水的制备

PSCs负载的生物墨水的制备遵循了我们之前研究中的方法（Niu et al., 2025）。简而言之，纳米淀粉悬浮液

超声波辅助3D打印构建了3D细胞排列

为了构建具有空间有序结构的3D生物打印结构，我们开发了一个能够生成可编程驻波场的声流控喷嘴模块。如图1a所示，声学操控系统包括一个3D打印喷嘴、聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具和一对压电换能器。通过频率和振幅匹配的相反传播声波的叠加来实现驻波（最小压力幅度）的形成

结论

生物3D打印在控制打印结构中细胞的空间排列方面面临一个根本性挑战。为了解决这个问题，我们开发了一种将可编程超声波驻波集成到打印过程中的声流控喷嘴。这种方法成功地将鱼类卫星细胞（PSCs）引导到预定义的高密度图案中。4000 kHz的超声波处理最为有效，产生了具有优异细胞增殖率的构建（25.1 × 10⁶细胞/cm³）

作者贡献

• D.
  L.和J. C.监督了这项研究。D. L.、R. N.和E. X.设计了项目。E. X.和R. N.进行了实验并分析了数据。Y. D.和Q. C.为讨论提供了支持。所有作者讨论了结果并参与了最终手稿的撰写。

CRediT作者贡献声明

牛瑞豪：撰写——原始草稿，数据管理。徐恩波：撰写——审阅与编辑。邓勇：方法学。陈启和：撰写——审阅与编辑。陈俊：研究。刘东红：撰写——审阅与编辑，资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

我们感谢浙江大学上海高等研究院的Starry Night Science Fund（SN-ZJU-SIAS-004）和中国国家重点研发计划（2022YFF1101800）的资助支持。