《Food Research International》：Pea protein isolate?sodium alginate-based plant-based meat analogue: dual crosslinking and molecular insight mechanisms
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葡萄发酵过程中意大利与希腊葡萄酒微生物群落及代谢特征差异研究，采用整合枪式宏基因组学与靶向代谢组学方法，揭示两地真菌群落组成差异（希腊以Torulaspora delbrueckii为主，意大利以Kluyveromyces marxianus和Lactobacillus为主），代谢模式受地理环境影响显著，尤其在能量、碳水化合物及氨基酸代谢通路中表现明显。
Paola Di Gianvito|Vania Sáez|Maria Dimopoulou|Christina Papandreou|Nicola Francesca|Urska Vrhovsek|Kalliopi Rantsiou|Luca Cocolin|Panagiotis Arapitsas|Vasileios Englezos
都灵大学农业、林业与食品科学系，Largo Paolo Braccini 2号，10095 Grugliasco，意大利
摘要
葡萄酒微生物组是塑造葡萄酒风土特色的关键因素。迄今为止，人们对微生物特征如何影响葡萄酒代谢谱型的理解仍然有限。为了解决这一问题，本研究采用了整合性的宏基因组学和非靶向代谢组学方法，来研究意大利和希腊收获的麝香葡萄在发酵过程中涉及的微生物组的组成和功能。β多样性分析显示了意大利和希腊葡萄园中真菌群落的差异。发酵过程中多样性的显著减少表明了接种的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的主导地位。LefSe分析发现希腊样本中Torulaspora delbrueckii的数量较多，而Kluyveromyces marxianus和乳酸菌在意大利样本中更为丰富。功能分析揭示了核苷酸、脂肪酸和赖氨酸代谢的地理差异。能量、碳水化合物和氨基酸代谢发生了显著变化，反映了风土特征对微生物活动的具体影响。这些代谢组学数据表明，不同地区的微生物群落及其代谢路径存在差异，这些差异受到风土条件和发酵过程的影响。本研究的结果证明了多组学方法在识别特定产品的真菌群落和葡萄酒代谢特征方面的有效性，为确保葡萄酒的 authenticity 和质量控制提供了新的工具。
引言
过去十年中，组学技术的进步彻底改变了食品分析领域，催生了“食品组学”这一概念（利用组学工具提供关于不同表达水平的分子信息，并将这些数据整合到系统生物学框架中）（Valdés等人，2022年）。这些新兴方法最初专注于食品安全，如今已应用于广泛的研究领域，包括质量分析、地理来源研究、可追溯性分析、微生物群落的功能成分研究以及复杂生物系统的研究（Balkir等人，2021年；Boutsika等人，2023年；Shi等人，2026年）。在发酵过程中应用这些技术为研究不同阶段的微生物组提供了宝贵的机会，使得能够详细表征微生物、追踪其相互作用及其代谢活动（Srinivas等人，2022年）。
在发酵食品中，葡萄酒因其全球分布、经济价值以及传统和文化意义而成为研究最深入的产品之一。微生物组在将葡萄汁转化为发酵饮料并塑造葡萄酒独特风味方面的核心作用已被充分证实（Alexandre等人，2020年；Belda等人，2020年）。了解哪些微生物执行哪些功能、它们如何在生态系统中相互作用，以及种群动态的变化如何影响发酵过程，对于管理和提升葡萄酒品质至关重要（Conacher等人，2021年），同时也有助于确保不同年份葡萄酒品质的一致性。这种持续的相互作用随着时间的推移塑造并强化了葡萄酒的独特风土特征（Belda等人，2020年），并决定了与特定地区相关的风味和品质（Franco等人，2024年）。
许多研究使用依赖培养和不依赖培养的技术探索、鉴定和分离葡萄汁和葡萄酒中的微生物群落（Morgan等人，2017年）。Sirén等人（2019年）曾综述了组学技术在葡萄酒微生物生态学研究中的应用，而Belda等人（2020年）和Alexandre等人（2020年）讨论了风土因素的影响。迄今为止，代谢组学方法已被用于研究中国（Yue等人，2024年）、智利（Sáez等人，2021年）、意大利北部（Duley等人，2024年）及其他地区的葡萄园风土特征（Alanón等人，2015年；Pinu，2018年）。这类分析能够高通量地识别和量化细胞产生的代谢产物，从而更全面地分析细胞的代谢和表型特征（Pinu，2018年），并有助于寻找特定生物标志物以识别问题、监测发酵过程并评估特定技术对葡萄酒成分的影响（Belda等人，2020年）。
扩增子测序技术在许多研究中被广泛用于研究葡萄园和葡萄酒中的微生物组（Sternes等人，2017年）。该技术已被应用于研究世界各地不同地区的风土特征，包括纳帕县（Bokulich等人，2016年）、加利福尼亚和俄勒冈（Reiter等人，2021年）、意大利北部和西班牙北部（Mezzasalma等人，2017年）、智利（Miura等人，2017年）、西班牙（de Celis等人，2024年）以及塞浦路斯（Kamilari等人，2021年）（综述见Liu等人，2019年）。基于DNA的宏基因组测序可分为两种方法：扩增子测序（也称为metabarcoding或metataxonomics），涉及对微生物组样本中特定基因组区域的PCR扩增和测序；另一种是非靶向的shotgun宏基因组测序，可测序样本中的所有遗传物质（Billington等人，2022年）。后者能够更全面地研究微生物群落及其在酿酒过程中的相互作用，并提供更高的分辨率和功能途径的见解（Sirén等人，2019年）。
据我们所知，只有少数研究应用了shotgun测序技术来研究葡萄汁发酵过程。Sternes等人（2017年）对比了Chardonnay发酵不同阶段的扩增子测序和shotgun测序方法，发现大多数检测到的物种在这两种方法之间存在高度相关性，但某些物种的检测结果存在高估现象。另一项研究利用shotgun测序技术研究了Cabernet Sauvignon葡萄汁中的微生物群落结构和功能潜力，发现葡萄汁中含有丰富的对发酵过程重要的酶（Ghosh等人，2021年）。Gao等人（2024年）探讨了微生物群落与Cabernet Sauvignon自然发酵过程中主要代谢物生成之间的联系，发现Saccharomyces属菌株是风味生成的主要贡献者，其次是Hanseniaspora、Tatumella和Oenococcus属菌株。
多组学技术的不断发展提高了从葡萄酒微生物组中提取的信息量和复杂性（Belda等人，2020年；Walsh等人，2023年）。宏基因组学、转录组学、代谢组学、统计学和生物信息学等工具的结合有助于深入了解酿酒过程。这种协同方法不仅加深了我们对葡萄酒生产过程中复杂机制的理解，还促进了行业创新和品质提升。这种方法对于理解整个微生物群落对最终产品的贡献至关重要（Walsh等人，2023年）。尽管这种多学科方法已在其他食品领域（如普洱茶、香肠和奶酪熟成）的研究中取得成功应用，但在葡萄酒领域的应用仍不够充分（Sirén等人，2019年）。Bokulich等人（2016年）通过结合扩增子测序和代谢组学分析，证明了当地微生物群落与葡萄酒生产区域的感官特征之间存在明显的相关性。
同样，在本研究中，我们采用了整合性的宏基因组学和代谢组学方法来研究希腊利姆诺斯岛和意大利皮埃蒙特地区生产的麝香葡萄酒所特有的真菌微生物组。通过全宏基因组shotgun测序和非靶向代谢组学分析，探讨了这两个地区在酒精发酵过程中的真菌微生物组。该方法旨在阐明微生物群落在酿酒过程中的演变和功能贡献，以及它们与接种的酿酒酵母之间的相互作用。
实验设计
2023年收获了来自意大利皮埃蒙特地区和希腊利姆诺斯岛的两个不同葡萄园的Vitis vinifera L. Muscat葡萄。这些葡萄分别在都灵大学实验酒窖（Bonafous，Chieri，意大利）和Nikolou酒庄（Attica，希腊）进行酿酒，遵循相同的白葡萄酒酿造工艺。在每个酒庄，葡萄压榨后，果浆在相同的罐中混合并冷却处理。
发酵结束时的主要酿酒参数
意大利和希腊的发酵同时进行。意大利样本的初始葡萄汁含糖量为198.3克/升，pH值为3.15；希腊样本的初始含糖量为185.8克/升，pH值为3.16（数据未显示）。有趣的是，两种样本的糖分均被完全消耗（2.0克/升），但发酵时间有所不同：意大利的发酵过程持续了25天，而希腊的发酵过程仅需14天。讨论
葡萄酒的质量在很大程度上取决于葡萄汁中的本土微生物群落，即使在接种了酵母的情况下也是如此，因为这些微生物群落具有自身的代谢活动并与接种的酵母相互作用。先前的研究揭示了不同国家和同一地区内不同葡萄园之间微生物群落组成的地理差异（Alexandre等人，2020年；Belda等人，2020年）。此外，这些微生物群落对葡萄酒风味和品质的形成具有重要影响。
结论
葡萄酒的风土特征涵盖了多种因素，如微生物群落的分布、微生物菌株的遗传多样性及其在葡萄园和酿酒过程中的生态相互作用。因此，它们在塑造葡萄酒独特的风味和香气方面起着关键作用，即使使用了接种的酵母菌株也是如此。
作者贡献声明
Paola Di Gianvito：撰写初稿、方法论设计、实验设计、数据分析、数据整理。Vania Sáez：实验设计、数据分析、数据整理。Maria Dimopoulou：撰写、审稿与编辑、实验设计。Christina Papandreou：实验设计、数据分析。Nicola Francesca：撰写、审稿与编辑。Urska Vrhovsek：撰写、审稿与编辑、方法论设计、实验设计。Kalliopi Rantsiou：撰写、审稿与编辑、方法论设计、实验设计。Luca Cocolin：撰写——资助
本研究得到了都灵大学2022年国际化资助项目（意大利都灵）以及欧盟共同资助的ERDF 2014–2020计划（意大利特伦托自治省）的支持（Fruitomics项目）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢Nikolou酒庄提供希腊葡萄样本，同时感谢Ilektra Ksenou在希腊样本的葡萄酒分析方面提供的技术支持。
