本地龙舌兰菌株之间的酵母相互作用对龙舌兰汁发酵过程中乙酸和乙酯产量的影响

《Food Research International》：Impact of yeast-yeast interactions among autochthonous agave strains on acetate and ethyl ester production during agave juice fermentation.

龙舌兰发酵中九种本土酵母 pairwise 互作研究发现：S. cerevisiae与P. kluyveri协同显著提升长链乙酯产量（较单菌提高2-3倍），H. lachancei抑制酯类生成。混合发酵通过营养竞争、代谢交叉馈赠等机制影响挥发性物质谱，为定制龙舌兰香气提供新策略。

　　

埃德温·J·巴尔博萨-埃尔南德斯（Edwin J. Barbosa-Hernández）|梅尔乔尔·阿雷亚诺-普拉扎（Melchor Arellano-Plaza）|豪尔赫·韦尔丁（Jorge Verdín）|亚历杭德罗·佩雷拉-桑塔纳（Alejandro Pereira-Santana）|曼努埃尔·基尔希迈尔（Manuel Kirchmayr）

工业生物技术，哈利斯科州技术与设计研究及援助中心（Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Dise?o del Estado de Jalisco A.C.），地址：Camino Arenero 1227, Col. El Bajío del Arenal, C.P. 45019, Zapopan, Jalisco, 墨西哥

摘要

在混合培养中，酵母之间的相互作用会显著影响次级代谢产物的合成。其中，挥发性酯类和醇类的合成不仅受微生物群落动态的调控，还决定了发酵饮料的感官特性。尽管这些化合物非常重要，但人们对来自龙舌兰发酵的本地酵母如何相互作用以及它们如何参与香气形成知之甚少。本研究调查了从龙舌兰酒生产中分离出的九种酵母之间的配对相互作用。通过连续培养在代谢培养基中评估了它们的生长反应，并在龙舌兰汁中进行混合发酵以评估其对挥发性化合物产生的影响。研究结果表明存在明显的相互作用效应：Saccharomyces cerevisiae来源的培养基抑制了大多数其他酵母的生长，而Hanseniaspora lachancei和Zygosaccharomyces bailii则常常促进生长。在共培养条件下，特定的菌株组合显著改变了挥发性化合物的组成。例如，S. cerevisiae与Pichia kluyveri共同培养时产生的异戊基乙酸酯和乙酸乙酯的含量是单独培养时的2-3倍，在某些情况下，某些酯类仅出现在混合培养中。多变量分析证实，这种组合（尤其是S. cerevisiae - P. kluyveri）与高水平的中间链乙酯的产生密切相关。这些发现表明，利用本地龙舌兰酵母之间的相互作用动态是一种有前景的策略，可以用来调整香气组成，其应用范围可扩展到多种酒精发酵过程。

引言

酒精发酵涉及复杂的微生物群落，其中酵母物种之间既竞争又合作，并相互影响彼此的代谢（Fleet, 2003）。发酵不仅仅是简单的糖转化为乙醇的过程，而是多种酵母（和细菌）产生多种代谢产物的过程，这些代谢产物决定了群落的组成和动态，进而影响香气和风味（Steensels & Verstrepen, 2014）。在许多传统饮料（如葡萄酒、啤酒、苹果酒、清酒和蒸馏酒）中，非Saccharomyces酵母与S. cerevisiae共存，共同塑造了复杂的香气（Varela, 2016）。最近的研究表明，在多种发酵体系中（包括苹果酒和啤酒），混合培养显著增强了酯类的形成并丰富了香气（Huang et al., 2024; Sola et al., 2024）。不同酵母菌株的共培养通常会产生更丰富和更广泛的挥发性化合物谱型，最新研究还证实非Saccharomyces酵母可以通过β-葡萄糖苷酶活性、氮代谢和其他途径调节酯类的生物合成（Gao et al., 2022; Xu et al., 2022）。例如，将S. cerevisiae与Torulaspora delbrueckii一起接种在葡萄酒中可以增加水果酯类和高级醇的含量（Comitini et al., 2021）。这些相互作用可能是协同的（促进某些代谢产物的合成），也可能是拮抗的（一种菌株抑制另一种菌株），具体取决于菌株种类和条件（Romano et al., 2022），其机制包括营养竞争（Pérez-Nevado et al., 2006）、杀伤性毒素（Englezos, Rantsiou, et al., 2019）和代谢交叉喂养（Jolly et al., 2017; Ponomarova et al., 2017）。

尽管葡萄酒和其他饮料中酵母之间的相互作用已有充分记录，但使用龙舌兰汁研究本地龙舌兰酵母的代谢效应仍不够明确。大多数关于代谢机制的见解（如营养吸收模式、抑制性代谢产物的产生和挥发性化合物的合成途径）都是在葡萄酒酵母中获得的（Comitini et al., 2021），然而这些见解是否适用于龙舌兰等非葡萄酒系统尚不清楚。此外，对墨西哥各地自发龙舌兰发酵的调查显示存在多种非Saccharomyces物种（Gallegos-Casillas et al., 2024），这表明传统的酿酒模型可能无法反映龙舌兰发酵的生态特性。此外，混合发酵的结果在不同菌株间存在高度特异性（Wang et al., 2016），表明仅基于属级别的概括是不够的。综上所述，需要使用本地龙舌兰分离株进行系统的配对相互作用研究，并量化这些相互作用如何在龙舌兰发酵条件下影响酯类的生物合成。

在龙舌兰汁用于制作龙舌兰酒和梅斯卡尔酒的发酵过程中，酵母在产生挥发性酯类、醇类和有机酸方面起着关键作用，这些成分决定了酒的感官特性（Díaz-Monta?o et al., 2008）。传统的龙舌兰发酵通常依赖于本地酵母的自然群落，而不是纯种接种（Lachance, 1995）。这些本地菌株（包括Hanseniaspora spp、Pichia spp、Torulaspora spp等）之间以及与添加的Saccharomyces启动菌之间会相互作用（Aldrete-Tapia et al., 2022）。例如，与T. delbrueckii和S. cerevisiae共培养可以改变龙舌兰汁中酯类、高级醇和醛类的含量（Nu?ez-Guerrero et al., 2016），这种相互作用可能通过营养竞争、细胞间接触和代谢物交换等机制实现（Dimopoulou et al., 2023; Liu et al., 2017; Petitgonnet et al., 2019）。然而，这些机制在龙舌兰发酵中的具体作用程度以及它们是否会导致特定菌株的挥发性化合物产量变化仍不完全清楚。

尽管已有大量关于葡萄酒和其他饮料中酵母相互作用的研究，但使用龙舌兰汁研究本地龙舌兰酵母的代谢效应仍然有限。大多数关于代谢机制的见解（如营养吸收模式、抑制性代谢产物的产生和挥发性化合物的合成途径）都是在葡萄酒酵母中获得的（Comitini et al., 2021），但其是否适用于龙舌兰等非葡萄酒系统仍不明确。此外，对墨西哥各地自发龙舌兰发酵的调查揭示了多种非Saccharomyces物种的存在（Gallegos-Casillas et al., 2024），这表明传统的酿酒模型可能无法准确反映龙舌兰发酵的生态特性。此外，混合发酵的结果在不同菌株间具有高度特异性（Wang et al., 2016），这表明基于属级别的概括是不够的。因此，需要使用本地龙舌兰分离株进行系统的配对相互作用研究，并量化这些相互作用如何在龙舌兰发酵条件下影响酯类的生物合成。

与大多数仅研究少数几种模型酵母的先前研究不同，本研究评估了九种本地龙舌兰菌株之间的21种配对相互作用，同时测量了多种挥发性化合物的动态变化。由于酵母的代谢行为在不同菌株间存在显著差异，本研究重点关注特定本地菌株之间的相互作用，而不是试图进行属级别的概括。这种实验规模，结合严格的相互作用标准（要求混合培养的结果超过或低于单菌株对照），提供了迄今为止最全面和系统的龙舌兰发酵中酵母相互作用评估。

这项对本地菌株组合的系统性评估提供了迄今为止关于龙舌兰发酵中微生物相互作用的最详细研究之一。重要的是，我们的结果表明，精心挑选的酵母共培养有可能影响甚至调整龙舌兰发酵的香气输出。通过研究本地龙舌兰菌株之间的相互作用，特别是对挥发性化合物的合成，本研究旨在填补这一空白，并为其他使用混合培养的酒精发酵过程提供有益的见解（Leroy & De Vuyst, 2004）。

酵母菌株和培养基

本研究使用了从自发龙舌兰酒发酵过程中分离出的九种酵母菌株（Quesada, 2017），并通过MALDI-TOF质谱技术进行了鉴定（García-Gamboa et al., 2021）。这些菌株包括两种Saccharomyces cerevisiae菌株（Sc1, Sc4）、Kluyveromyces marxianus（Km）、Pichia kluyveri（Pk）、Torulaspora delbrueckii（Td）、Zygosaccharomyces bailii（Zb）、两种Hanseniaspora lachancei菌株（Hl1, Hl6）以及Lachancea fermentati（Lf）。详细信息见...

结果与讨论

本研究通过评估大量本地龙舌兰菌株之间的配对组合，扩展了目前对酵母相互作用的理解。通过将生长相互作用测定与香气轮廓的多变量分析相结合，本研究为区分优势菌株、抑制菌株和协同酯类生物合成提供了一个全面的框架。

结论

研究表明，在龙舌兰汁发酵过程中，酵母之间的相互作用显著影响了乙酸盐、乙酸酯及相关挥发性化合物的产生。某些菌株组合增强了酯类的合成，而其他组合则对其产生影响甚微或甚至减少了酯类的生成。特别是S. cerevisiae与P. kluyveri的组合一致地促进了长链乙酸酯的生成，而H. lachancei则倾向于降低酯类的产量。

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CRediT作者贡献声明

埃德温·J·巴尔博萨-埃尔南德斯（Edwin J. Barbosa-Hernández）：撰写——初稿、方法论、数据分析、概念化。 梅尔乔尔·阿雷亚诺-普拉扎（Melchor Arellano-Plaza）：撰写——审稿与编辑、数据分析、概念化。 豪尔赫·韦尔丁（Jorge Verdín）：撰写——审稿与编辑。 亚历杭德罗·佩雷拉-桑塔纳（Alejandro Pereira-Santana）：撰写——审稿与编辑。 曼努埃尔·基尔希迈尔（Manuel Kirchmayr）：撰写——审稿与编辑、方法论获取、数据分析、概念化。

资助

本研究得到了科学、人文、技术及创新部（Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación, SECIHTI）的支持，项目编号为#25628。

带有星号（*）的数值与其相应的单菌株对照值有显著差异（Tukey检验，95%置信度，p<0.05）。未检测到（N.D.）的数值以及以百分比（v/v）表示的完整平均值±标准差见补充材料S2。

未引用的参考文献

González-Robles和Cook, 2016

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。