《Environmental Science & Technology》：Chemical-Class Submixture Screening Reveals Drivers of Endocrine Disruption in Personalized Human Blood POP Mixtures
化学类别亚组分筛选揭示个体化血液POP混合物中的内分泌干扰驱动因子
引言
内分泌干扰是环境污染物对人类健康产生长期不良影响的主要机制之一。持久性有机污染物（POPs）因其在环境中的普遍存在性、生物累积性、持久性以及在人体血液中较长的生物半衰期而受到特别关注。尽管许多此类化合物已被限制或禁用，但它们仍可从原始来源材料中渗出，并经常在饮用水、食品和人类血液中被检测到。目前的化学风险评估大多依赖于单一化合物的毒理学研究，但这种方法忽略了人类同时且长期暴露于来自不同化学类别的多种环境污染物的事实。由于地理、饮食、个人护理产品使用和其他生活方式决定因素，个体间的人类化学血液暴露组差异很大。
使用环境提取物进行的全混合物毒性研究最准确地代表了现实生活中的暴露场景，但此类方法可能受到未知混合物组成和低实验灵敏度的限制。由于环境混合物的复杂性，以及生物样品（例如血液）中存在的生物活性内源性化合物可能干扰解释，识别驱动观察到的毒性效应的特定化合物或化学类别仍然是一个重大挑战。一种更受控的替代方法涉及从纯化合物储备液中重建确定且现实的混合物，从而实现更高的实验灵敏度、测试更宽的浓度范围以及基于不同时间点、地点或个体改变混合物的能力。
鉴于类固醇激素生物合成在内分泌调节中的核心作用，定量激素产生变化的体外模型为评估复杂化学混合物的内分泌干扰效应提供了一种机制信息丰富的方法。NCI-H295R类固醇生成测定（OECD TG#456）被认为是一种敏感且可重复的体外评估雌二醇和睾酮合成影响的方法，其结果与体内研究结果一致。最近，我们进行了首个个体化混合物毒理学研究，使用定义的混合物（PM）匹配在个体中测量的真实世界混合物组成。这些混合物使用非接触式声波液体处理在多孔板中从小体积储备液中快速定量重建。在暴露于这些重建的、先前在瑞典成年人个体血液样本中测量到的POPs个体化混合物的H295R细胞中，观察到对细胞活力以及细胞雌二醇和睾酮的显著影响。重要的是，混合物效应并非总是可以从同一系统中单个POPs的研究中预测。为了识别这些真实世界PMs中的毒性驱动因子和潜在机制，我们假设可以再次使用非接触式液体处理来可重复地生成按化学类别划分的POPs个体化亚混合物，其效应可以直接与相应的完整混合物进行比较。
本研究旨在调查个体化POP混合物对H295R细胞活力和性激素产生影响的驱动因子和机制。为此，我们对最近研究中检查的四种完整PMs（PM#3、PM#4、PC1-OC-Mix和PC2-PFAS-Mix）进行了细分，将其分为基于化学类别的亚混合物，并筛选它们对H295R细胞的影响。开发了高内涵分析（HCA）方案以扩展H295R类固醇生成测定，从而能够对氧化应激诱导进行机制评估。本研究为进一步了解存在于个体人血液中的真实世界POP混合物的交互性内分泌干扰效应提供了见解。
方法
细胞培养
人肾上腺皮质癌细胞系H295R购自美国模式培养物集存库（ATCC），并根据OECD测试指南#456进行培养，有轻微修改。H295R细胞系具有内源性类固醇激素生产能力。简言之，细胞在T75培养瓶（Sarstedt）中于37°C、5% (v/v) CO2 的湿润气氛中，使用1:1的Dulbecco改良Eagle培养基和营养混合物F-12（DMEM/F-12）维持培养，培养基补充有1%含有胰岛素、人转铁蛋白和硒酸（Corning Inc.）的ITS + premix以及2.5% NuSerum（Fisher Scientific）。实验在传代5至10次之间进行，以确保睾酮和雌二醇的稳定基础产量。
化合物和混合物生成使用非接触式液体处理
根据瑞典V?sterbotten干预计划（VIP）队列血液样本中的丰度，选择了属于PFAS、OCPs、PCBs和PBDEs类别的24种POPs。这些化合物对H295R细胞活力以及睾酮和雌二醇合成的影响先前已作为单个化合物（在浓度-反应中测试，1 nM至10 μM）和基于个体血液水平重建的个体化混合物进行了研究。此处，对诱导内分泌干扰效应和降低细胞活力的选定个体化混合物，进一步研究了按化学类别分组的亚混合物（补充表S1）。测试了所有PFAS、PCBs、OCPs和PBDEs作为亚混合物，以评估它们对整体生物活性的贡献。这包括来自VIP队列中随机选择的两个个体的PMs（PM#3和PM#4），以及基于主成分分析（PCA）得分战略选择的两个PMs，一个其POP混合物变异主要由有机氯（OC）化合物驱动（PC1-OC-Mix），另一个主要由PFAS驱动（PC2-PFAS-Mix）。
测试化合物购自Wellington Laboratories、Cambridge Isotope Laboratories、LGC standards和Toronto Research Chemicals，在Strand等人2024年的补充表S2中有详细描述。简言之，所有化合物如先前所述溶解在二甲基亚砜（DMSO，CAS 67-68-5，Sigma-Aldrich，纯度≥99.9%）中，并转移到Echo兼容的384孔源板（Beckman Coulter Life Science）中。使用Echo 550声波非接触式液体处理器（Beckman Coulter Life Sciences）从这些化合物储备液中在96孔板（Thermo Fisher Scientific Inc.）中生成处理混合物。使用PlateLoc热微孔板密封机（Agilent）密封板，并在-20°C下储存，除非立即使用。
POP混合物对H295R细胞睾酮和雌二醇合成及细胞活力的影响
为评估按化学类别分组的POP混合物对睾酮和雌二醇合成的影响，使用了基于OECD测试指南（TG）#456的H295R类固醇生成测定的改编版本，以提高通量，如先前详细描述。简言之，96孔组织培养微孔板（Sarstedt）每孔接种50,000个细胞过夜，排除最外圈孔以最小化边缘效应。然后用POP混合物、溶剂对照（DMSO 0.1%）或类固醇生成抑制（prochloraz，1 μM）或刺激（forskolin，10 μM）的阳性对照处理细胞，所有处理均在细胞培养培养基中稀释。每个处理条件测试六个技术重复。暴露48小时后评估细胞活力。收集条件培养基并在-80°C下储存，直至通过ELISA定量睾酮和雌二醇。
通过MTT分析细胞活力
处理结束后，将暴露的细胞在37°C下与0.5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）溶液（在DMEM/F-12中稀释）孵育1小时。代谢活性细胞在线粒体内将MTT还原为不溶性甲臜晶体。去除过量MTT溶液后，将所得甲臜溶解在DMSO中，并在500 rpm下振荡10分钟。然后使用SpectraMax i3x酶标仪（Molecular Devices LLC）在570 nm处测量吸光度。细胞活力计算为减去空白后溶剂对照的百分比。
通过ELISA定量类固醇激素睾酮和雌二醇
使用ELISA试剂盒（ADI-901-008和ADI-901-065，ENZO Life Sciences Inc.）根据制造商说明对H295R细胞产生的睾酮和雌二醇进行定量。从96孔板的每个孔中收集200 μL条件培养基并分析睾酮和雌二醇含量。激素浓度（pg或ng/mL）相对于溶剂对照进行标准化，以确定处理细胞类固醇激素合成的相对变化。根据OECD指南标准，仅当阳性对照prochloraz和forskolin对类固醇激素合成产生预期的抑制或刺激效应时，才将实验纳入分析。具体而言，prochloraz需将两种激素水平降低至溶剂对照的≤0.5倍，而forskolin需诱导睾酮增加≥1.5倍，雌二醇增加≥7.5倍。
使用qRT-PCR定量基因表达
将细胞以每孔750,000个的密度接种，并在6孔板中处理48小时，每个条件设技术重复。处理后，用冷PBS冲洗细胞，并使用RNeasy Mini kit（74104，Qiagen）根据制造商说明提取总RNA。使用Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Scientific）评估RNA浓度和纯度。使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒（K1641，Thermo Fisher）从每个样品1 μg总RNA合成互补DNA（cDNA）。使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）进行定量实时PCR（qRT-PCR），使用4 μL cDNA和6 μL含有Maxima SYBR Green PCR Master Mix（K022，Thermo Fisher）的PCR混合液。使用的引物序列如下：对于CYP11A1，正向引物GGAGTCCTGTTGAAGAAGTCGG，反向引物ACGAAGTCCCGAGACACTGC；对于CYP19A1（芳香化酶），正向引物AAGACGCAGGATTTCCACAGAAG，反向引物CAGGTCACCACGTTTCTCTGCT。qRT-PCR热循环方案包括95°C初始变性30秒，随后进行40个循环的95°C变性15秒和60°C退火60秒。在最终解离阶段进行从60°C到95°C以0.5°C递增的熔解曲线分析，以确认扩增产物的特异性。基因表达水平以β-肌动蛋白作为内参基因进行标准化，并表示为相对于相应溶剂对照的倍数变化。
使用高内涵分析定量氧化应激
在两个时间点测量细胞内处理依赖性氧化应激：短期0-2小时时间序列和暴露48小时后。将H295R细胞以每孔50,000个细胞的密度接种在黑色、透明底96孔板中。对于短期时间序列，24小时后更换培养基，细胞再孵育48小时以复制类固醇生成测定中使用的条件。然后用Hoechst 33342（5 μM）和二氢乙锭（DHE，15 μM）在FluoroBrite DMEM中染色40分钟。氟ogenic探针DHE被超氧化物和其他活性氧（ROS）羟基化，形成2-羟基乙锭，后者嵌入DNA并在606 nm发射荧光信号。
染色后，短期暴露组的细胞用PBS冲洗，并在FluoroBrite DMEM中暴露于个体化POP混合物、溶剂对照（DMSO，0.1%）或阳性对照（Menadione，100 μM）。使用ImageXpress Micro XLS共聚焦高内涵分析系统（Molecular Devices）在0、0.5、1和2小时使用DAPI和Cy3滤光片以每孔5个位点成像。对于48小时时间点，在相同条件下接种细胞。24小时后，更换为POP混合物或溶剂对照。暴露48小时后，用PBS冲洗细胞，染色并使用与短期时间序列相同的方案成像。Menadione（100 μM）在成像前30分钟加入作为阳性对照。使用MetaXpress软件及其集成的荧光应用模块进行图像分析以量化荧光强度。基于三个独立实验（n = 3）的六个技术重复计算每个处理条件的DHE平均荧光核强度。
统计分析
为分析类固醇生成和细胞活力数据并考虑实验间的变异性，应用线性混合模型（LMM），将处理浓度和混合物类型作为固定效应，将生物学重复（独立实验）作为随机效应项，使用Rstudio中的lme4包。随后在同一包内进行Dunnett's多重比较检验。将每个混合物浓度组（1×、10×和100×）与相应的溶剂对照进行比较。分析在对数标准化数据上进行，因为这改善了与LMM的兼容性。超过平均值2个标准差的数据点在分析前被视为异常值并移除。用于统计分析的脚本可在以下网址获取：
https://github.com/flerpan01/POP-screening 。使用GraphPad Prism版本8.4.3中的单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett's多重比较检验对图像分析数据进行统计显著性检验。
结果
化学类别亚混合物在H295R细胞中诱导对细胞活力或睾酮和雌二醇合成的独特效应
在13个测试的化学类别亚混合物中，有5个在一个或多个浓度下观察到睾酮合成增加，其中3个混合物甚至在环境相关的1×浓度下诱导效应（图1和补充图S1）。在PM#4的PCB亚混合物的所有浓度以及PC1-OC-Mix的BDE亚混合物的10×浓度下，观察到细胞活力轻微下降（5-7%）（图1和补充图S1和表S2）。雌二醇是最不敏感的终点，仅有一个亚混合物在其最高测试浓度（100×，PC1-OC-Mix中的PCBs）下，诱导雌二醇合成比溶剂对照增加23%。
在四个测试的PMs中，只有PC1-OC-Mix [68.2 nM]包含所有六种PFAS。其他混合物缺少PFUnA（PC2-PFAS-Mix [74.5 nM], PM#4 [58.5 nM]）或同时缺少PFUnA和PFDA（PM#3 [25.5 nM]）（表S2）。除了PM#3的PFAS亚混合物（其组分最少且浓度最低）外，其他三个PFAS亚混合物均诱导睾酮合成。在这些活性亚混合物中，睾酮水平比溶剂对照增加9%至15%（表S1）。对于PM#4和PC1-OC-Mix，效应在1×浓度下明显，而PC2-PFAS-Mix的PFAS亚混合物仅在最高浓度（100×）下有效。
所有四个个体化完整混合物都包含完整的10种PCBs组，但浓度因混合物而异。总浓度最高的两个PCB亚混合物显示出对细胞活力（PM#4，1×至100×，比对照下降7-5%）和雌二醇水平（PC1-OC-Mix，100×，增加23%）的统计学显著影响。相比之下，浓度较低的PCB亚混合物（PC2-PFAS-Mix和PM#3）即使在10×和100×浓度下也未影响任何测量终点。
PC-2-PFAS-Mix和PC1-OC-Mix都包含所有五种OCPs，而PM#3和PM#4分别缺少DDE或DDT。两个OCP亚混合物在PM#3的1×浓度（13%）和PM#4的10×浓度（8%）下诱导了微小但统计学显著的睾酮合成增加。未观察到PC2-PFAS-Mix或PC1-OC-Mix的OCP亚混合物有任何效应，值得注意的是，它们分别包含OCPs的最低（3.85 nM）和最高（30.4 nM）总浓度。PM#3和PM#4活性亚混合物中的OCPs总浓度中等且彼此相似（4.52-4.73 nM）。这些结果表明，仅OCPs总浓度不是预测类固醇激素合成效应的最强指标，而混合物组成是关键因素。值得注意的是，PM#3和PM#4的活性亚混合物都缺少DDE或DDT，而未显示效应的亚混合物则包含所有五种OCPs together。这可能表明DDE和DDT，或所有五种OCPs的完全组合，可能通过拮抗相互作用减弱生物反应。
只有一个混合物PC1-OC-Mix包含超过一种可以测试为亚混合物的PBDE。该亚混合物的中间浓度（10×，5.9 nM）显著降低细胞活力5%。然而，与溶剂对照相比，这种变化很小，并且在100×（59 nM）未观察到相同效应。
化学类别亚混合物的效应与相应完整混合物的比较
对于PM#3，从亚混合物测试中可以明显看出OCPs驱动了完整混合物的效应（图1），因为在完整混合物的1×浓度下观察到睾酮合成增加15%，这与用相同浓度（1×）的OCP亚混合物（β-HCH、氧化氯丹、反式九氯和DDT）单独处理的细胞中观察到的13%增加密切相关。然而，在较高浓度下观察到微小差异（图1）。虽然PM#3作为完整混合物也在10×浓度下诱导睾酮合成，但OCP亚混合物在100×浓度下刺激睾酮，但在中间浓度10×下没有。尽管这些变化具有统计学显著性，但增加的幅度相对较小，与溶剂对照相比在10%至13%之间（图1）。
类似地，对于PM#4，完整混合物对睾酮合成的影响（10×浓度下增加16%）可部分归因于OCP亚混合物，后者在相同浓度下诱导了8%的增加（图1）。与PM#3一样，OCP亚混合物的效应并不严格遵循与完整混合物相同的剂量-反应模式。PM#4 OCP亚混合物的统计学显著效应在10×和100×浓度下均被观察到，而完整混合物仅在10×浓度下显示效应。在PM#4的PFAS亚混合物中也观察到类似趋势，其在1×和100×浓度下影响睾酮合成，但在10×浓度下没有（图1）。完整的PM#4混合物在100×浓度下也比对照引起细胞活力小幅下降（5%）。类似地，PM#4 PCB亚混合物在所有三个浓度（1×、10×和100×）下均观察到微小但统计学显著的活力下降（5-7%），而与完整混合物仅在最高浓度下降低活力形成对比。
在PC1-OC-Mix的完整混合物测试中，与溶剂对照相比，H295R细胞活力在10×和100×浓度下下降了13-18%。在1×浓度下，混合物对活力没有影响，而睾酮合成增加了11%。在相应的亚混合物中，PFAS亚混合物在1×浓度下诱导了类似的（9%）睾酮合成增加，这可能解释了完整混合物的效应。值得注意的是，PFAS亚混合物在较高浓度下也诱导了睾酮合成（高达15%），这在完整混合物中并不明显，但可能在这些浓度下因活力下降而被掩盖（图1，表S2）。值得注意的是，只有PC1-OC-Mix的PBDEs亚混合物显著降低了细胞活力，并且该效应仅在10×浓度下观察到，活力比溶剂对照下降5%。这表明PBDEs可能通过与其他亚混合物的相互作用，促进了在完整混合物中观察到的细胞毒性。
对于PC2-PFAS-Mix，暴露于所有三个测试浓度的完整混合物的细胞与对照相比显示出活力下降（11-13%）（图1，补充图S1和表S2）。然而，其任何化学类别亚混合物在任何浓度下均未诱导任何统计学显著的活力变化，这表明不同类别的化学物质之间存在毒理学相互作用。
高内涵筛选显示个体化POP混合物对氧化应激指标DHE无影响
在暴露于完整个体化POP混合物（PC1-OC-Mix或PC2-PFAS-Mix）0、0.5、1、2或48小时的H295R细胞中，两种混合物均未诱导氧化应激，通过DHE氧化测量。选择这些混合物进行测试是基于它们在低或中等浓度下降低细胞活力的能力。阳性对照menadione在0.5、1和2小时显著增加了核DHE信号，与DMSO溶剂对照相比（图2）。除阳性对照外，所有样品中从0到2小时信号均出现轻微但不显著的下降，这可能是由于实验过程中的光漂白所致。
暴露于个体化混合物后限速类固醇生成基因CYP11A1的下调
在用影响睾酮水平的三种完整个体化混合物处理的细胞中，PM#3和PM#4的最高浓度（100×）显著下调了CYP11A1表达，分别降至溶剂对照水平的45%和53%。相比之下，PC1-OC-Mix未引起CYP11A1表达的任何变化。任何测试的POP混合物在任何浓度下均未影响CYP19A1（芳香化酶）表达（图3）。
讨论
在本研究中，我们调查了个体化混合物对H295R细胞活力和性激素产生影响的化学驱动因子和潜在机制。为此，我们扩展了先前开发的用于评估类固醇生成效应（特别是对睾酮和雌二醇）以及细胞活力的混合物筛选策略。将混合物按化学类别（PFASs、PCBs、OCPs和PBDEs）分离，以研究亚混合物的贡献并识别完整混合物中观察到的效应的主要驱动因子。当作为亚混合物测试时，个体化POP混合物 诱 导 的 几 种
