《Frontiers in Immunology》：MAGL-18c attenuates LPS-induced sepsis-associated liver injury by inhibiting TGF-β/Smad signaling and remodeling medium- and long-chain fatty acid metabolism
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本研究深入探讨了新型单酰基甘油脂肪酶（MAGL）抑制剂MAGL-18c在脂多糖（LPS）诱导的脓毒症相关肝损伤（SALI）中的保护作用及机制。文章揭示MAGL-18c通过抑制TGF-β/Smad信号通路减轻炎症，改善线粒体功能障碍与细胞凋亡，并重塑中长链脂肪酸（MCFAs/LCFAs）代谢平衡，为SALI的治疗提供了多靶点干预新策略。
1 Introduction
脓毒症是一种危重的全身性高炎症状态，可导致广泛的组织损伤和多器官功能障碍。世界卫生组织报告显示，脓毒症患者的总体生存率仅约为30%。在可能受累的各个器官中，肝功能不全与高死亡率和不良预后密切相关，使其成为可靠的临床指标。脓毒症相关肝损伤（SALI）的发病率据报告在34%至46%之间，伴有肝功能障碍或衰竭的脓毒症患者死亡率可达54%–68%。目前，对于SALI尚无标准化治疗方案；大多数方法依赖于脓毒症的常规管理结合肝功能障碍的对症治疗。尽管关于SALI机制和影响因素的研究日益增多，但针对特定分子通路的有效药物仍然缺乏。因此，迫切需要开发新的治疗策略以减轻脓毒症诱导的肝损伤。
脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的组成部分，可导致急性和长期肝损伤。它主要通过炎症、氧化应激、细胞死亡和自噬对机体造成损害。单酰基甘油脂肪酶（MAGL）是一种丝氨酸水解酶，可分解内源性大麻素2-花生四烯酰甘油（2-AG），并将单甘油酯转化为甘油和脂肪酸，从而影响炎症和内源性大麻素平衡。LPS可增加MAGL活性，加速2-AG分解，并提高花生四烯酸（AA）水平，而AA是前列腺素、白三烯和血栓烷等重要分子的前体。MAGL存在于多种组织中，其中约10–20%分布于肝脏。MAGL抑制剂已在不同疾病模型中显示出益处，包括脑部疾病和脓毒症。MAGL-18c是一种强效的MAGL抑制剂，据报道具有肾脏保护作用。在本研究的测试中，其与MAGL的对接能量为?8.9 kcal/mol，酶活性测定显示IC50为662.6 nM，最大抑制率约为76%，表明其具有有效且可逆的抑制作用。基于此，我们决定研究MAGL-18c对小鼠脓毒症所致肝损伤的影响。
本研究旨在探讨MAGL-18c缓解LPS诱导的SALI的作用机制。为此，我们对肝组织进行了蛋白质组学和代谢组学分析，以表征蛋白质表达和小分子代谢物的变化。这些数据用于分析SALI期间肝脏对MAGL-18c响应的分子通路。总之，本研究揭示了MAGL-18c肝脏保护作用的机制基础，为其在SALI预防和治疗以及未来药物开发中的潜在应用提供了理论框架。
2 Materials and methods
本研究使用6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠，通过腹腔注射LPS（25 mg/kg）建立SALI模型。小鼠被随机分为对照组、LPS组和MAGL-18c治疗组（1、2.5和5 mg/kg）。在LPS攻击前60分钟给予MAGL-18c或生理盐水。LPS注射后24小时处死小鼠，收集血液和肝组织样本。通过生存分析、脓毒症临床评分评估整体保护效应。通过检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平评估肝功能。通过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（如髓过氧化物酶MPO染色）评估肝组织病理变化和中性粒细胞浸润。通过蛋白质印迹法（Western blot）和实时定量PCR（qPCR）检测凋亡相关蛋白（Bax, Bcl-2, Cleaved-Caspase-3）和炎症因子（TNF, IL-1β, IL-6, IL-10）的表达。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测肝组织匀浆中ATP、MAGL、大麻素受体CB1/CB2和2-AG的水平。通过流式细胞微球阵列（CBA）检测血清炎症因子。通过透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构。通过非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行肝脏代谢组学分析。通过数据非依赖性采集质谱（DIA-MS）进行蛋白质组学分析。通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析中长链脂肪酸（MCFAs/LCFAs）谱。所有数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）及事后Bonferroni校正进行统计学分析，P < 0.05认为有统计学意义。
3 Results
3.1 Systemic protective effects of MAGL-18c: survival benefit and clinical symptom improvement
为验证MAGL-18c是否能预防LPS诱导的脓毒症，我们评估了小鼠的生存率和疾病严重程度。高剂量LPS（2.5 mg/kg）处理后，所有生理盐水处理的小鼠在72小时内死亡。相比之下，预先给予MAGL-18c的小鼠生存率显著提高，约80%的小鼠存活超过72小时。LPS注射后24小时评估的临床严重程度评分显示，LPS处理小鼠在毛发状况、运动活性、呼吸状态、眼部外观和反应性方面均出现显著恶化。MAGL-18c预处理显著降低了这些评分，表现为皮毛状况、活动能力和呼吸功能的改善。这些发现表明，MAGL-18c不仅能延缓脓毒症进展，还能改善整体临床症状并提高生存率，提示其作为脓毒症相关并发症有效治疗剂的潜力。
3.2 MAGL-18c alleviates LPS-induced SALI in mice
为评估MAGL-18c的肝脏保护作用，我们检测了LPS攻击后的肝脏相关参数。LPS引起显著的体重减轻和肝脏指数增加，表明存在全身性炎症和肝肿大。MAGL-18c，特别是在2.5 mg/kg剂量下，减轻了体重下降并降低了肝脏指数。LPS处理小鼠血清ALT、AST和LDH水平显著升高（约为对照组的3-4倍），反映了严重的肝损伤，而MAGL-18c治疗显著降低了这些酶的水平，其中2.5 mg/kg剂量效果最强。MAGL-18c还减弱了LPS诱导的血清总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）升高。H&E染色组织学评估显示对照组肝结构正常，而LPS诱导了广泛的炎症浸润和脂肪变性。MAGL-18c治疗改善了这些病理特征，特别是在2.5 mg/kg剂量下，恢复了肝细胞排列，减少了炎症，并改善了核形态。这些结果证明MAGL-18c对LPS诱导的肝损伤提供了有效的保护。
3.3 MAGL-18c attenuates LPS-induced inflammatory cytokine production and neutrophil infiltration
为评估MAGL-18c的抗炎作用，检测了血清和肝脏中炎症细胞因子的水平。LPS显著增加了促炎细胞因子TNF、IL-1β和IL-6，而IL-10水平在血清中升高但在mRNA水平降低，可能反映了代偿性抗炎反应。MAGL-18c治疗（其中2.5 mg/kg剂量总体效果最佳）显著降低了血清和肝匀浆中TNF、IL-1β和IL-6的水平，同时增加了IL-10水平。MPO的免疫组织化学染色显示，LPS诱导小鼠肝脏中存在显著的中性粒细胞浸润，表现为MPO阳性区域增加。MAGL-18c治疗以剂量依赖的方式降低了MPO表达，在2.5和5 mg/kg剂量下其水平接近对照组，表明有效抑制了中性粒细胞驱动的肝脏炎症。
3.4 MAGL-18c inhibits the apoptosis caused by LPS-induced mitochondrial dysfunction
为评估MAGL-18c对LPS诱导的SALI中线粒体功能和细胞凋亡的影响，量化了肝脏ATP水平。LPS处理显著降低了ATP含量，而MAGL-18c恢复了ATP水平，其中2.5 mg/kg剂量效果最强。基于药效学结果，该剂量被选用于所有后续实验。透射电子显微镜显示LPS组中线粒体嵴破坏和断裂，部分线粒体与脂滴相关。定量分析显示LPS处理的肝脏中嵴密度降低、脂滴相关线粒体比例增加以及外膜破裂率升高，所有这些均被MAGL-18c显著改善。与线粒体保护作用一致，LPS上调了促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase-3，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2，而MAGL-18c在蛋白和mRNA水平均逆转了这些变化，表明MAGL抑制减轻了线粒体功能障碍诱导的肝细胞凋亡。
3.5 MAGL-18c alleviates LPS-induced SALI through TGF-β/Smad pathway in proteomics
为研究MAGL-18c在脓毒症诱导肝损伤中的分子机制，对肝组织进行了无标记定量蛋白质组学分析。火山图显示对照组和LPS组之间有1,445个差异表达蛋白（DEPs），MAGL-18c组和LPS组之间有138个DEPs，表明MAGL-18c部分逆转了LPS诱导的蛋白质组变化。维恩图确定了110个重叠的DEPs，这些蛋白被LPS显著改变并被MAGL-18c调节。对这些重叠DEPs的KEGG通路分析显示，它们在炎症和代谢相关通路中显著富集， notably the TGF-β/Smad signaling pathway，突出了其在SALI发病机制和缓解中的作用。层次聚类显示不同的蛋白表达模式，MAGL-18c部分恢复了正常水平。蛋白质组学表明LPS处理的肝脏中TGF-β1和磷酸化Smad2/3上调，这通过Western blot得到证实。MAGL-18c治疗显著降低了TGF-β1和p-Smad2/3的表达，表明对TGF-β/Smad通路的调节有助于其肝脏保护作用。
3.6 MAGL-18c regulates liver metabolic disorders caused by LPS
为探究与LPS诱导肝损伤相关的代谢变化及MAGL-18c的作用，对肝组织进行了非靶向代谢组学分析。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）揭示了对照组、LPS组和MAGL-18c组之间 distinct 的代谢谱。以变量重要性投影（VIP）>1和P < 0.05作为筛选差异代谢物的条件。共鉴定出LPS组与对照组之间的24种差异代谢物，主要由中链和长链脂肪酸（MCFAs和LCFAs）组成。这些代谢物通过MetaboAnalyst 6.0进行分析，揭示了五个显著改变的代谢通路：不饱和脂肪酸的生物合成、嘧啶代谢、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和脂肪酸生物合成。这些发现表明MAGL-18c减轻了LPS诱导的代谢紊乱，尤其是在脂质相关通路中。
3.7 MAGL-18c restores hepatic MCFAs and LCFAs homeostasis in LPS-induced SALI
为检查SALI期间MCFAs和LCFAs的改变，进行了GC-MS分析。热图聚类分析显示各组间脂肪酸谱存在差异趋势，反映了广泛的脂质代谢变化。MAGL-18c部分恢复了几种长链多不饱和脂肪酸，表明存在代谢正常化的趋势。LPS增加了促炎脂肪酸（如棕榈酸），同时减少了抗炎脂肪酸（如十五烷酸）。尽管MCFA和LCFA水平的变化未达到统计学显著性，但MAGL-18c显示出改善脂质代谢的一致趋势。结合减少的肝脂滴和增强的脂肪酸氧化标志物，这些发现表明MAGL-18c可能有助于恢复肝脏脂质平衡。
3.8 MAGL-18c-mediated bidirectional regulation of 2-AG/CB and AA/PGE2
为探索MAGL-18c的作用机制，我们首先检测了其对MAGL–2-AG–大麻素受体轴的影响。所有MAGL-18c剂量组均抑制了LPS诱导的MAGL活性，导致其底物2-AG积聚。2-AG的增加选择性上调了CB2受体表达，同时下调了CB1受体表达，突出了对内源性大麻素通路的选择性调节。随后，我们对代谢组学结果进行了深入分析，发现下游促炎介质发生显著改变。MAGL-18c治疗减少了花生四烯酸（AA）的产生，并显著抑制了前列腺素E2（PGE2）的水平。这些结果表明MAGL-18c限制了AA/PGE2驱动的炎症信号传导，提示其肝脏保护作用涉及增强2-AG/CB2信号传导和抑制AA介导的促炎反应两个方面。
4 Discussion
SALI是导致脓毒症患者多器官功能障碍和高死亡率的关键致病因素。尽管炎症是核心病理生理机制，但其本身不能完全解释器官衰竭的进展。新兴证据表明，代谢失调、全身性炎症和细胞凋亡相互关联，共同驱动肝损伤。值得注意的是，炎症驱动的肝细胞凋亡和代谢稳态破坏在疾病进展中起着关键作用。我们的研究表明，MAGL-18c通过靶向病理网络中的多个关键节点，对小鼠SALI发挥显著的保护作用：保护线粒体结构和功能、调节TGF-β/Smad通路以及重塑脂肪酸代谢。
MAGL-18c治疗显著提高了生存率，改善了肝功能，并减轻了组织病理学损伤。在LPS攻击的小鼠中，72小时生存率达到约80%，而未处理对照组全部死亡，同时临床脓毒症评分反映了疾病严重程度的降低。肝损伤的关键指标，包括血清AST、ALT和LDH，均显著降低，并伴有中性粒细胞浸润和MPO活性的减少。同时，促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF）减少，而IL-10水平在血清和肝组织中均增加，表明向抗炎状态的转变。
除了抗炎作用外，MAGL-18c显著保护了线粒体结构和功能。已知脓毒症会损害线粒体完整性和细胞生物能量学；然而，MAGL-18c治疗维持了线粒体形态，提高了肝细胞ATP水平，并减少了膜损伤和脂滴相关异常。血清TC和TG水平也降低，反映了线粒体性能和脂质处理的改善。这些发现表明MAGL-18c有助于恢复肝细胞的生物能量能力，这对于满足脓毒症期间的高能量需求至关重要。
细胞凋亡和线粒体功能障碍在脓毒症诱导的肝损伤中密切相关。LPS诱导的脂质代谢异常增加了脂滴形成并引起脂毒性，损害线粒体完整性并触发细胞凋亡。该过程涉及Bax激活、Caspase-3切割和Bcl-2下调，进一步加剧肝细胞损伤。MAGL-18c恢复了脂肪酸代谢，降低了脂毒性，并支持线粒体功能，同时增加Bcl-2水平并减少Bax和活化的Caspase-3，从而抑制线粒体介导的细胞凋亡。MAGL抑制、减轻炎症和恢复线粒体功能的这种联合效应为其在脓毒症相关肝损伤中的保护作用提供了机制基础。
蛋白质组学分析表明TGF-β/Smad信号通路显著富集，该通路在SALI中被异常激活并被MAGL-18c减弱。LPS诱导的炎症介质增加了TGF-β1表达和Smad2/3磷酸化，促进肝细胞凋亡并通过抑制线粒体生物发生和脂肪酸氧化来损害能量代谢。这种线粒体功能障碍可进一步放大TGF-β信号传导，形成加剧炎症和细胞死亡的正反馈环路。MAGL-18c中断了这一环路，提供了支持肝细胞存活和促进肝脏恢复的保护作用。
肝脏脂质积聚在脓毒症中很常见，并通过激活非氧化代谢途径和产生损伤线粒体并触发细胞凋亡的脂毒性代谢物而促进肝损伤。MAGL抑制已在多种疾病模型中显示出抗炎作用。在我们的研究中，MAGL-18c改善了血清生化指标，减少了脂滴相关的线粒体缺陷，并重塑了肝脏脂肪酸谱，包括MCFAs和LCFAs。尽管一些变化未达到统计学显著性，但它们为未来的研究提供了有意义的假设。
在机制上，MAGL-18c将脂质代谢与炎症控制联系起来。通过调节内源性大麻素系统和脂肪酸可用性，它增强了细胞能量生产，选择性上调了CB2受体信号传导，并抑制了促炎性CB1活性，从而减弱了TGF-β相关的转录反应。结合MAGL活性、其底物2-AG、CB1/CB2受体表达的ELISA测量结果和代谢组学数据，这些发现表明MAGL-18c协调了代谢和免疫通路，将脂质稳态与炎症调节联系起来，从而赋予了对脓毒症相关肝损伤的保护作用。
总之，在LPS诱导的SALI中，TGF-β信号传导、线粒体凋亡和脂质代谢紊乱形成了一个紧密互连的网络。MAGL-18c通过作用于多个节点来打破这一循环，恢复肝脏稳态，并提供广泛的保护效应。这种多通路调节机制强调了MAGL抑制剂在脓毒症相关肝损伤中的治疗潜力。
本研究主要评估了LPS模型中早期（24小时）肝损伤；长期效果需要在CLP模型或慢性肝损伤环境中进行验证。由于实验限制，未将MAGL-18c与其他MAGL抑制剂进行直接比较，其选择性、动力学特性和潜在的脱靶效应值得进一步研究。尽管如此，其对2-AG水平和CB2信号传导的调节表明MAGL抑制可能代表其主要作用机制。
5 Conclusion
总之，我们的研究揭示了MAGL-18c通过统一的机制保护 against SALI。通过抑制MAGL，MAGL-18c同时抑制了过度炎症，抑制了适应不良的TGF-β信号传导，保护了线粒体结构和功能，减少了凋亡信号，并恢复了脂质代谢。这些发现突出了其作为脓毒症治疗干预措施的潜力，特别是通过靶向TGF-β轴和代谢重编程。
