《Frontiers in Nutrition》：Lunasin alleviates pulmonary inflammation in A549 alveolar epithelial cells and C57BL6/J mice in obese-mimicking conditions
1 引言
近十年间，肺部疾病已成为最普遍的急性与慢性病症之一，导致巨额医疗支出。肥胖通过引发肺部炎症、纤维化和呼吸功能恶化，显著加重这一负担。在病态肥胖中，功能失调的脂肪组织维持全身性低度炎症，进一步损害肺部免疫防御并增加呼吸系统并发症的易感性。除炎症外，过量脂肪堆积还会对呼吸产生机械性限制，增加通气需求及呼吸系统疾病风险。
肥胖期间，脂肪细胞作为内分泌器官发挥作用，分泌脂肪因子、细胞因子和趋化因子，招募多种免疫细胞。脂肪细胞释放更高水平的促炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、瘦素和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1），同时伴随抗炎脂联素的减少，共同促成了促炎微环境。这种失衡的微环境损害肺功能，加速各种肺损伤和疾病的进展，并增加对哮喘、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、阻塞性睡眠呼吸暂停以及严重冠状病毒病（COVID-19）等疾病的易感性。肺纤维化与慢性肺部炎症密切相关，导致进行性瘢痕形成、结构重塑和呼吸功能受损。研究表明，饮食诱导的肥胖与肺纤维化之间存在联系，主要由炎症介质TNF-α、MCP-1和转化生长因子β（TGF-β）驱动。
关于肺部免疫防御，免疫功能受损的肥胖个体在2020年COVID-19大流行期间尤为脆弱。系统综述和荟萃分析一致报告肥胖会增加COVID-19的严重程度、不良结局和死亡率。因此，肥胖已被确定为该传染病不良结局的重要风险因素。
肺部防御的关键组成部分是表面活性物质系统，其覆盖肺泡以降低表面张力并防止肺泡塌陷。由肺泡II型（AT II）细胞分泌的肺表面活性物质是两亲性分子，由磷脂、胆固醇和表面活性蛋白（SPs）组成，其中SP-A和SP-D参与先天免疫防御并促进病原体清除。此外，SP-B和SP-C参与呼吸过程中表面活性物质的合成、结构和铺展。因此，表面活性物质对于维持肺功能和呼吸健康至关重要。
饮食策略和生活方式改变与减轻肥胖和降低呼吸系统疾病风险相关。在这些方法中，食物来源的生物活性化合物作为肺部疾病的潜在辅助疗法引起了越来越多的科学兴趣。此外，饮食因素直接影响肠道微生物群、代谢物和肠道环境，这些变化可通过循环影响远处器官。肠道微生物、代谢物和免疫细胞在此环境中被"训练"，然后迁移至肺部并调节气道免疫。膳食生物活性化合物与微生物群的相互作用已得到充分证实。膳食纤维及其衍生的短链脂肪酸可以调节多种免疫细胞，介导参与慢性肺病的肠-肺串扰，并发挥抗炎特性。多酚和多糖也能缓解炎症性肠病并增加有益微生物的丰度。最近的研究表明，在高脂饮食中干预大豆来源的水解肽可显著降低小鼠血清瘦素和胰岛素抵抗，减轻肠道炎症并调节肠道屏障。
基于这些证据，探索天然生物活性化合物以缓解肺部疾病的兴趣日益增长。Lunasin是一种存在于豆类和谷物中的种子肽，具有多种生物活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、调节血脂、血糖稳态和免疫调节特性。因此，Lunasin有望成为解决肥胖相关合并症的制剂。 thus，研究其在肥胖相关条件下对肺泡的影响，可能为了解其减轻肺部炎症和纤维化的能力提供见解。
肥胖是一种损害多器官系统的慢性疾病。因此，迫切需要针对炎症和纤维化的有效治疗策略。目前仍缺乏在肥胖条件下研究Lunasin对肺泡II型细胞影响的研究。因此，本研究旨在肥胖模拟条件下研究Lunasin对A549肺上皮细胞的影响，重点关注促炎介质、信号通路和上皮-间质转化（EMT）标志物。为了验证这些发现，我们在补充了Lunasin的高脂饮食喂养的小鼠中进行了体内实验，以评估肺和脾脏的免疫反应。
2 材料与方法
2.1 细胞培养
A549肺上皮细胞购自生物资源保存与研究中心。细胞的完全培养基为Ham's F-12k培养基，含7 mM葡萄糖和10%胎牛血清（FBS）。细胞在37°C、5% CO2和湿润条件下培养。
2.2 肥胖相关条件
为了在体外模拟肥胖微环境，A549细胞根据肥胖相关条件用棕榈酸（PA）处理。PA用绝对乙醇制备，然后与1%牛血清白蛋白（BSA）在Ham's F-12k培养基中于37°C孵育2小时。灭菌后，PA储备液在-20°C保存。PA的工作浓度为500 μM。此外，脂多糖（LPS）被用作另一种肥胖模型，因为肥胖中内毒素水平较高，并且LPS通常刺激急性炎症。LPS的工作浓度为10 μg/ml。此外，TGF-β用于在体外诱导肺纤维化，工作浓度为10 ng/ml。LPS和TGF-β制备后于-20°C保存以备将来使用。Lunasin肽为化学合成，纯度超过95%。Lunasin的工作浓度为5 μM和50 μM。细胞在肥胖相关条件下培养，加或不加Lunasin处理24小时。
2.3 细胞活力
A549细胞用系列浓度的Lunasin、PA或LPS处理48小时。去除培养基后，细胞在0.5 mg/ml MTT溶液中于37°C孵育3小时。吸弃液体后，加入DMSO，并在摇床上溶解甲臜晶体。使用分光光度计在540 nm波长下测定吸光度。细胞活力按公式计算并以百分比表示。
2.4 使用酶联免疫吸附测定（ELISA）评估细胞因子分泌
A549细胞在存在或不存在500 μM PA或10 μg/ml LPS的情况下培养，并用Lunasin处理48小时。然后收集上清液进行细胞因子分析。IL-6、MCP-1和TGF-β的分泌通过ELISA进行分析。
2.5 迁移实验
将细胞以1.1 × 105细胞/孔的密度接种于24孔板中过夜，直至细胞融合度达到80%。细胞用Lunasin预处理4小时，然后用1,000 μl移液器吸头划伤细胞单层。随后，将培养培养基更换为含0.5% FBS的F-12培养基、5 ng/ml TGF-β或100 ng/ml重组小鼠瘦素，加或不加Lunasin，培养48小时。在划痕后0、24和48小时使用显微镜在100倍放大倍数下进行成像。使用Image J量化迁移面积，结果以迁移指数表示。此外，根据生物制药参考文献计算愈合曲线下面积（AUC）。
2.6 Western blot分析
细胞用Lunasin预处理4小时，然后在存在或不存在Lunasin的情况下用500 μM PA或10 μg/ml LPS培养24小时。然后收集细胞并使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。根据BCA蛋白测定法调整细胞裂解物的蛋白上样量，并在100°C水浴中变性10分钟。然后，样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）并电转移至PVDF膜。简要地说，膜在明胶-NET缓冲液中封闭，然后与一抗孵育，包括抗表面活性蛋白D（SP-D）、抗磷酸化核因子κB（NF-κB） p65（磷酸化Ser536）、抗NF-κB p65和抗GAPDH，以及过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗小鼠或抗兔二抗。洗涤后，使用化学发光检测试剂盒显示目标蛋白。使用ImageJ软件对图像进行量化。
2.7 EMT免疫荧光
将细胞以2.5 × 104细胞/ml的密度接种于μ-Slide八孔板中，并用Lunasin预处理4小时。然后细胞在存在或不存在Lunasin的情况下用5 ng/ml TGF-β或100 ng/ml瘦素培养48小时。洗涤后，细胞用4%多聚甲醛固定10分钟，并用0.2% Triton-X 100透化15分钟。洗涤后，载玻片用0.3% Triton-X 100中的5%正常血清封闭，然后与E-钙黏蛋白和波形蛋白一抗以及CF?488A和CF? 594标记的荧光二抗一起处理。细胞核用NucBlue?固定细胞Ready Probes?试剂染色。使用荧光显微镜在200倍放大倍数下拍摄图像，并通过在显微镜下计数三个随机视野使用ImageJ进行量化。
2.8 实验动物与饮食
雄性C57BL/6JNarl小鼠购自国家实验动物中心。实验动物方案获得批准，动物护理按照动物福利、伦理指南和3R原则进行。小鼠群养于聚碳酸酯笼中，光/暗周期为12小时，温度维持在24°C ± 2°C，湿度保持在60 ± 10%。经过一周的适应期后，将6周龄小鼠分为两组：高脂高果糖（HF）组和在HF饮食中添加富含Lunasin的大豆分离蛋白（HFL）组（饮食中Lunasin浓度为483 mg/kg；每组n = 6）。HFL组中的Lunasin浓度相当于FDA推荐的每日大豆蛋白摄入量的两倍。实验性HF饮食中，45%的热量来自脂肪，27%的热量来自果糖，模拟饮食诱导的肥胖。小鼠从6周龄至22周龄自由摄食实验饮食。每天监测动物的整体健康状况、活动水平和食物摄入量。每周测量体重以评估其健康状况并识别任何潜在的痛苦。实验结束时，按照批准的指南对小鼠实施安乐死以尽量减少疼痛和痛苦。通过CO2吸入实施安乐死，CO2流量维持在腔室体积的30%/分钟，并在呼吸停止后维持CO2流量至少1分钟。暴露后，对死亡或深度麻醉的小鼠实施颈椎脱位以确保不可逆死亡。收集肺和脾脏样本并储存在-80°C以备将来分析。
2.9 肺组织和匀浆中的细胞因子分泌
肺组织分为两部分用于两个实验。首先，将肺组织切成0.1 mg的小块，并加入浓度为0.1 mg/ml的RIPA缓冲液以促进匀浆。然后将匀浆在4°C下以13,000 × g离心20分钟，收集上清液用于细胞因子分析。在另一个实验中，将肺组织切成0.05 mg的小块，并在24孔板中于1 ml RPMI-1640培养基（含1%胎牛血清）中培养，在存在或不存在1 μg/ml LPS的情况下进行促炎刺激。培养24小时后，收集上清液用于细胞因子分析。根据肺组织中单个蛋白浓度调整细胞因子水平。按照制造商的操作说明检测细胞因子IL-6、TNF-α和TGF-β。
2.10 脾细胞中的细胞因子分泌
收集脾脏，研磨，并用红细胞裂解液和氨氯 tris缓冲液处理以释放单个核细胞。用Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤后，将脾细胞以5 × 106细胞/ml的密度重悬于含10%小鼠血清替代物的RPMI-1640培养基中，接种于48孔板，并用10 μg/ml LPS和刀豆蛋白A（ConA）激活48小时。然后收集上清液用于细胞因子分析。所研究的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α和干扰素γ（IFN-γ），均按照制造商的操作说明进行分析。
2.11 统计分析
细胞研究中的数据来自至少三次独立实验。动物研究中的数据来自五到六只小鼠，以均值±标准误（SEM）表示。使用SPSS软件通过Student t检验进行统计分析。P < 0.05认为具有统计学显著性差异。
3 结果
3.1 使用PA和LPS在A549细胞中模拟肥胖条件
用系列浓度的Lunasin、PA和LPS处理A549细胞24小时，通过MTT法检测细胞活力。分析培养上清液中的促炎细胞因子IL-6以确认试剂的毒性和刺激作用。用1至100 μM的Lunasin和0.1至20 μg/ml的LPS处理不影响A549细胞活力，表明这些处理无毒性；然而，浓度高于200 μM的PA显著降低细胞活力。关于促炎作用，用浓度高于500 μM的PA和浓度高于1 μg/ml的LPS处理的A549细胞显示IL-6产量显著增加，但50 μM Lunasin降低了IL-6分泌。因此，在未来的实验中，选择5 μM和50 μM的Lunasin处理剂量，分别对应低剂量和高剂量，这也与先前关于其抗炎特性的研究相似。使用500 μM的PA和10 μg/ml的LPS来模拟肥胖条件，参考这些浓度，它们代表了以IL-6增加为特征的炎症反应。
3.2 Lunasin在肥胖微环境下抑制A549细胞的炎症
为了探讨Lunasin是否影响肥胖条件下的炎症介质，细胞在高葡萄糖、PA或LPS条件下培养以模拟肥胖微环境，并用TGF-β处理以诱导纤维化。因为长期肥胖常伴有胰岛素抵抗和高血糖症。因此，高葡萄糖条件也包含在本实验设计中。通过ELISA分析培养上清液中细胞因子IL-6、MCP-1和TGF-β的产量。首先，为了确认葡萄糖水平是否影响细胞炎症，细胞在正常葡萄糖（7 mM）或高葡萄糖（35 mM）培养基中培养，并同时用PA、LPS或TGF-β刺激。在肥胖相关刺激下，促炎细胞因子IL-6和MCP-1显著增加。在高葡萄糖培养基中，IL-6和MCP-1水平分别通过TGF-β和LPS刺激而增加。虽然TGF-β分泌由LPS刺激诱导，但不受葡萄糖水平的影响。因此，炎症细胞因子IL-6和MCP-1受高葡萄糖影响，但未在纤维化介质TGF-β中观察到这种影响。
Lunasin处理降低了在正常葡萄糖培养基中培养的A549细胞中由PA诱导的IL-6和MCP-1产量，并抑制了由LPS触发的MCP-1分泌。在5 μM的低剂量下，Lunasin还降低了在高葡萄糖培养基中培养的细胞中对LPS刺激的TGF-β产量，并且与对照组相比，略微抑制了PA诱导的TGF-β。总的来说，Lunasin在肥胖模拟微环境中显著降低了促炎介质IL-6和MCP-1以及促纤维化介质TGF-β的产量，且与葡萄糖水平无关。因此，后续实验使用正常葡萄糖结合PA或LPS进行。关于Lunasin剂量的有效性，5 μM的低浓度Lunasin显著降低了IL-6、MCP-1和TGF-β的产量，表明该水平是在A549细胞中实现抗炎活性的最佳水平。然而，50 μM的较高浓度略微降低了细胞活力，尽管效果不显著。
3.3 Lunasin通过NF-κB信号通路抑制SP-D
为了研究Lunasin是否调节SPs并提供保护作用，在自发、PA或LPS条件下用Lunasin处理A549细胞。检测了SP-A、SP-D及其可能的信号分子NF-κB的表达。通过ELISA测定，LPS刺激抑制了A549细胞中的SP-D水平，而与仅用LPS相比，Lunasin处理显著恢复了SP-D水平；然而，在SP-A中未观察到这种效应。根据Western blot分析，50 μM Lunasin在自发条件下持续增加SP-D产量。此外，LPS降低了SP-D蛋白水平，而5 μM Lunasin在LPS刺激下倾向于增加其表达，尽管差异不显著。ELISA和Western blot分析之间关于有效剂量的差异可能反映了检测分泌蛋白与细胞内蛋白以及处理时间的差异。
在一项深入研究中，分析了Lunasin处理后SP-D的分子信号，包括NF-κB及其磷酸化水平。LPS攻击显著增强了NF-κB的磷酸化，用5 μM Lunasin处理降低了这种磷酸化，但在PA模型中未观察到这种现象。基于这些证据，Lunasin通过抑制NF-κB磷酸化显著增强了SP-D蛋白表达，随后抑制了肥胖相关条件下A549细胞中炎症细胞因子的产生。
3.4 Lunasin不影响A549细胞的迁移或EMT表达
为了评估Lunasin是否干扰A549细胞的纤维化，在TGF-β和瘦素刺激下进行伤口愈合实验以模拟肥胖微环境。PA处理不影响细胞迁移；因此，将其排除在纤维化模型之外，数据未显示。分析伤口愈合实验以评估细胞迁移，并作为细胞纤维化的指标。划伤融合的细胞单层，并在0、24和48小时评估伤口闭合面积。对照组细胞层在划痕处显示出显著的距离。与对照组相比，TGF-β和瘦素显著促进细胞迁移，这反映在迁移指数和AUC上。然而，与对照组相比，Lunasin处理在划痕后未改变在TGF-β或瘦素刺激下的伤口愈合。
为了进一步评估Lunasin在纤维化中的作用，检测了A549细胞中的EMT标志物。通过免疫荧光显示，波形蛋白（红色）是一种间质标志物，在EMT期间高表达，而E-钙黏蛋白（绿色）是一种上皮标志物，在正常上皮细胞中丰富。荧光强度的量化证实TGF-β和瘦素刺激诱导了纤维化，波形蛋白表达显著增加，E-钙黏蛋白表达减少，验证了模型。Lunasin处理未改变EMT标志物表达或细胞迁移，表明它不直接干扰A549细胞的纤维化。然而，Lunasin降低了TGF-β产量，推测其在A549细胞纤维化的早期阶段可能具有潜在作用。未来的研究需要额外的分析，如组织学评估、Masson三色染色或α-SMA和胶原蛋白I染色来证实这一结论。
3.5 Lunasin抑制高脂饮食喂养小鼠肺中的促炎和促纤维化细胞因子
为了评估在体外观察到的Lunasin的抗炎作用是否可以在体内重现，用补充富含Lunasin的大豆分离蛋白的高脂饮食喂养C57BL/6小鼠。收集肺和脾组织以评估局部和全身免疫反应。肺组织用于评估目标区域的炎症，而脾脏显示全身的免疫反应。在研究结束时，小鼠的肺重和体重在各组之间没有差异，表明Lunasin不影响小鼠的肺质量或体重增加。然而，Lunasin改善了高脂饮食喂养小鼠的脂肪细胞大小和肝脏脂肪变性，表明Lunasin改善了肥胖相关的病理变化。通过ELISA分析小鼠肺匀浆中细胞因子IL-6、TNF-α和TGF-β的水平。与HF组相比，补充Lunasin的HF饮食喂养的小鼠显示TNF-α和TGF-β水平显著降低，并对IL-6有轻微影响。一致地，在离体肺组织培养上清液中，与HF组相比，HFL组中Lunasin补充显著降低了LPS诱导的TNF-α产量，并略微降低了TGF-β水平，而IL-6没有变化。肺组织中的MCP-1水平不受Lunasin处理的影响。总之，这些结果表明，Lunasin补充通过抑制高脂高果糖饮食喂养小鼠中的促炎细胞因子TNF-α和促纤维化介质TGF-β来减轻肺部炎症。
3.6 Lunasin调节高脂饮食喂养小鼠脾脏中的细胞因子分泌
通过测量培养的脾细胞上清液中细胞因子IL-6、TNF-α、IL-17A、IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌来评估Lunasin的免疫调节作用，即丝裂原LPS刺激的B淋巴细胞和ConA刺激的T淋巴细胞。两种丝裂原均显著增加细胞因子分泌。两组小鼠的脾重没有差异。然而，HFL组的脾细胞数量低于HF组。在HFL组的ConA刺激的脾细胞中，IL-17A、IFN-γ和IL-4的产量降低，但IL-2水平与HF组相比略有升高。相反，在LPS刺激的脾细胞中，HFL组小鼠显示IFN-γ分泌显著更高，而在ConA刺激的脾细胞中该水平较低。有趣的是，HFL组表现出辅助性T细胞（Th）1细胞因子IL-2水平升高和Th2细胞因子IL-4水平降低。为了确定Th1/Th2细胞的平衡，计算IL-2/IL-4和IFN-γ/IL-4的比率，以确认Lunasin补充显著增强了Th1极化。总之，Lunasin通过促进Th1反应和抑制高脂饮食喂养小鼠脾脏中的促炎IL-17A水平来调节全身免疫，表明其可改善肥胖相关的慢性炎症和免疫衰退。
4 讨论
肥胖是一种慢性疾病，通过损害多个器官（包括肺）的功能对健康产生负面影响。功能失调的脂肪组织导致肺部病理变化，因此探索能够在肥胖相关模型中调节肺部炎症和纤维化的生物活性化合物的潜力至关重要。本研究在体外发现，Lunasin通过上调SP-D和抑制NF-κB信号传导来抑制A549细胞中IL-6、MCP-1和TGF-β的产生，尽管它不影响纤维化的特征。在体内，喂养富含Lunasin的HF饮食的小鼠显示肺部细胞因子TNF-α和TGF-β水平降低，同时伴有脾细胞中Th1免疫反应增强和IL-17A分泌减少。这些发现首次揭示，Lunasin在降低肺上皮细胞和HF喂养小鼠肺组织中的炎症和促纤维化细胞因子产生方面起着关键作用，表明其在预防肥胖相关呼吸系统并发症方面的潜力。
肺泡II型（ATII）细胞在肺的结构维持、防御和修复中起着关键作用，执行上皮再生、表面活性物质分泌和免疫调节等重要功能。这些细胞参与防御病原体暴露和抵抗呼吸系统疾病。A549细胞在长期培养后表现出ATII样特征，由于ATII功能障碍在肺部疾病中的相关性，本研究使用该细胞来模拟肺泡。
肥胖通过释放脂肪因子、细胞因子和化学物质（如TNF-α、IL-6、CRP、瘦素和MCP-1）引发慢性低度炎症，同时降低抗炎脂联素水平。因此，这些介质招募免疫细胞，如巨噬细胞、B细胞和T细胞，它们大规模浸润脂肪组织并参与多种疾病的发展。在本研究中，使用高葡萄糖培养基、PA和LPS在体外模拟肥胖条件。在高葡萄糖培养基中培养的A549细胞显示IL-6和MCP-1水平升高。Lunasin在正常葡萄糖培养基中通过PA或LPS刺激抑制IL-6和MCP-1分泌，特别是在高葡萄糖培养基中通过LPS刺激降低TGF-β水平，表明Lunasin在肥胖相关条件下有效降低A549细胞中的促炎和促纤维化介质。
研究表明，Lunasin在各种模型中表现出抗炎作用。Lunasin还抑制巨噬细胞和脂肪细胞之间的细胞因子串扰，抑制LPS刺激下的ROS和MCP-1产生，并增强肥胖条件下巨噬细胞的免疫反应。在体内，Lunasin已显示通过抑制caspase-1、IL-1β和IL-18分泌，并可能通过调节NLRP3炎症小体
