《Frontiers in Ecology and Evolution》：CYP genes are duplicated in Drosophila suzukii and carry transposable elements
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本研究系统比较了害虫Drosophila suzukii与非害虫D. melanogaster细胞色素P450单加氧酶（CYP）基因中转座子（TE）的分布规律，发现D. suzukii特有的10个CYP基因重复事件中富含Helitron类转座子，其携带的转录因子结合位点（TFBS）可能通过外显子洗牌（exon shuffling）机制增强基因可塑性，为解析该入侵物种快速适应杀虫剂压力的基因组基础提供了新视角。
CYP基因在铃木果蝇中发生重复并携带转座子元件
基因重复和转座子（TE）插入是基因组进化的关键驱动力，并与昆虫杀虫剂抗性增强相关。本研究旨在比较入侵性害虫铃木果蝇（Drosophila suzukii）与非害虫黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，细胞色素P450单加氧酶（CYP）基因内部及侧翼区域TE的分布及其潜在影响。通过计算机模拟分析两种果蝇的CYP基因库和基因组结构，发现铃木果蝇特有10个重复的CYP基因，这些重复基因中富含TE片段，尤其是Helitron类转座子。在铃木果蝇中，36%位于CYP基因及其侧翼区域的TE序列携带推定转录因子结合位点（TFBS），提示其在基因调控中可能发挥作用。基于Helitron介导的外显子洗牌模型，这些元件可能促进基因重排，从而增强功能多样性。在基因组水平上，铃木果蝇的总体TE含量高于黑腹果蝇，且在CYP基因中相对富集。TE含量增加可能增强了基因组可塑性，进而促进该物种的入侵成功、快速种群增长及适应不同生境（如原生环境和农田）的能力。
引言
细胞色素P450单加氧酶（CYPs）是一组多样的同工酶，在内源性和外源性化合物代谢中起基础作用。作为古老且广泛分布的基因家族，CYPs几乎存在于所有生物体中。在昆虫中，它们对解毒过程至关重要，参与天然植物化感物质和合成杀虫剂的代谢。CYP基因表达和拷贝数变异常与节肢动物害虫代谢抗药性的发展相关。
杀虫剂抗性作为研究进化现象的宝贵模型，因为选择剂（杀虫剂）明确，且选择反应（抗性）通常迅速。例如，杀虫剂抗性与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中CYP6p3的过表达、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）脑中CYP6bq9的过表达相关。在桃蚜（Myzus persicae）中，抗性由CYP6cy3和CYP6g1的重复介导，而在黑腹果蝇中则涉及CYP6g1的重复和过表达。
除基因重复和调控变化外，转座子（TE）活性已成为调节CYP基因表达和驱动杀虫剂抗性进化的关键机制。TE是能在基因组内和基因组间移动的重复DNA序列，其移动性可影响基因组结构和功能，通过改变基因表达和增加基因组大小导致表型变化。在果蝇中，TE（包括插入和TE衍生片段）已被证明塑造CYP基因调控并贡献于杀虫剂抗性。例如，黑腹果蝇中CYP6g1的过表达与其上游Accord反转录元件的插入相关，而拟果蝇（D. simulans）中同源基因的过表达则由于其侧翼区域DOC元件的插入。此外，黑腹果蝇中CYP12a4的3'末端插入Bari-1元件可增强基因表达。其中，Helitrons——能够捕获和重排宿主基因片段的滚环DNA转座子——代表了一个特别动态的家族，其在本研究中被详细探讨。
果蝇物种作为遗传学和进化生物学的模式生物而闻名，但少数已成为重要的农业害虫。其中，铃木果蝇（Drosophila suzukii）是全球最具破坏性的水果作物害虫之一。原产于日本，铃木果蝇已扩散至亚洲、北美、欧洲和南美。雌性具有锯齿状产卵器，使其能在健康果实而非腐烂果实中产卵。由此产生的穿孔为病原体提供了入口，导致水果（主要是浆果）产量经济损失高达80%，并释放挥发性化合物吸引其他果蝇物种。一旦建立，铃木果蝇极难根除，导致因持续监测、强化管理、增加杀虫剂使用和采后水果分选而产生的生产成本增加。鉴于其入侵成功、广泛的生态耐受性和重度暴露于杀虫剂，铃木果蝇为研究基因重复和转座子如何贡献于基因组可塑性和适应性进化提供了理想模型。
理解铃木果蝇适应性和对控制措施抗性的遗传基础对于制定有效管理策略至关重要。该物种的测序基因组包含76个注释的CYP基因，而黑腹果蝇有99个。由于CYPs是昆虫中能够介导对所有主要类别杀虫剂抗性的主要代谢系统之一，检查这些基因及其相关TE和潜在调控效应，可以为理解杀虫剂抗性和物种入侵成功的遗传和分子机制提供宝贵见解。
为解决此问题，本研究主要目的是比较铃木果蝇和黑腹果蝇的CYP基因库，重点关注基因结构、TE插入在这些基因内部或附近的出现和分布，以探索它们对基因结构和TE衍生调控元件的潜在影响。我们假设转座子（TE）可能贡献于调控多样化，在铃木果蝇的适应性成功和杀虫剂抗性中起关键作用。
材料与方法
CYP基因的计算机模拟分析
CYP基因序列和结构直接从Gbrowser数据库中的 curated 基因组注释中获取，铃木果蝇使用注释版本v1，黑腹果蝇使用注释版本v3。仅包括蛋白质编码CYP基因。由于这些基因来自组装注释而非从头搜索，未遇到重叠或模糊命中。由于侧翼区域的转座子（TE）可提供新的转录调控信号，基于注释的基因坐标提取每个CYP基因上游10 kb（5'侧翼区域）和下游10 kb（3'侧翼区域）。检索到的序列在Gbrowser中进行视觉检查以比较物种间基因组特征。
使用R中的genoPlotR包进行并可视化铃木果蝇和黑腹果蝇之间的基因长度比较。在该包中，每个直系同源基因并排绘制以允许直接结构比较，能够可视化物种间的局部同线性，如外显子-内含子组织、总基因长度和TE插入位置。所有图形输出在Inkscape v0.92.1中精炼。
为提供系统发育背景，我们将Chiu等人（2013）生成的最大似然系统发育纳入我们的比较分析。我们进一步将这些分析扩展到包括铃木果蝇的两个姐妹物种——双纹果蝇（Drosophila biarmipes）和高桥氏果蝇（Drosophila takahashii）的直系同源CYP基因，并使用下面描述的相同基于RepeatMasker的流程筛选这些直系同源物的TE插入，以确保稳健的跨物种比较。
转座子的计算机模拟分析
为检测与CYP基因相关的TE存在，我们使用RepeatMasker网络服务器分析每个基因序列及其分别10 kb的5'和3'侧翼区域。搜索参数为：crossmatch、果蝇和基于GC水平的矩阵。TE分类根据使用Repbase的果蝇参考库的最高分匹配分配。由于“果蝇”RepeatMasker库针对黑腹果蝇优化，因此可能低估铃木果蝇中谱系特异性或近期分化的TE家族。
基于RepeatMasker输出，我们根据TE片段相对于CYP基因的基因组位置分类为：（i）内含子内，（ii）5'侧翼（转录起始位点上游10 kb内），或（iii）3'侧翼（转录终止位点下游10 kb内）。位于CYP基因及其10 kb侧翼区域内的TE序列进一步分析以识别推定转录因子结合位点（TFBS）。使用ConSite网络服务器进行链特异性预测，使用JASPAR CORE昆虫数据库（针对黑腹果蝇），应用90% TFBS截断分数，遵循Carareto等人（2013）的方法。
为评估CYP基因中TE插入数量是否与所研究物种的整体基因组TE组成成比例，从序列读取档案（SRA）获取Illumina reads：铃木果蝇——SRR942805（北美样本；Chiu等人，2013），黑腹果蝇——SRR1738161。使用RepeatExplorer在基于Galaxy的网络服务器上对NGS reads进行基于图的聚类，遵循Silva等人（2016）描述的流程。该分析提供了TE含量的全基因组估计和不同TE超家族的相对贡献，包括Helitrons，然后与重叠CYP基因的TE和Helitron拷贝比例进行比较。
统计分析
我们首先比较了每个物种内CYP基因和非CYP基因的大小分布。为此，从每个基因组随机选择500个额外基因的数据集。对于铃木果蝇，使用BEDTools v2.27.0随机抽样基因，随后识别其在黑腹果蝇中的直系同源物。由于基因大小分布不对称，使用中位基因长度而非均值。在每个物种内，使用Mann-Whitney非参数检验比较CYP基因长度与500个随机选择基因的长度。
为解释物种间整体基因组大小和基因长度分布的差异，我们通过每个物种中500个随机选择基因的中位大小对CYP基因长度进行归一化。归一化基因大小计算为每个基因的长度（以碱基对计）除以物种特异性500个随机选择基因的中位长度。然后应用Wilcoxon符号秩检验比较铃木果蝇和黑腹果蝇直系同源CYP的归一化大小。
使用四种方法比较铃木果蝇和黑腹果蝇之间的TE富集：（1）基因内部（包括其侧翼区域）的TE频率；（2）CYP基因及其侧翼区域内的TE频率；（3）CYP基因中TE频率与其在基因组其他基因中频率的比较；（4）CYP基因中Helitron插入频率与其在非CYP基因中频率的比较。使用具有1自由度和Yates连续性校正的卡方检验进行比较，这在
