《Frontiers in Immunology》：High PVR protein expression marks clear cell renal cell carcinoma with metastatic spread
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本综述系统探讨了脊髓灰质炎病毒受体（PVR）在膀胱癌和肾细胞癌（包括透明细胞和乳头状亚型）中的表达模式及其临床意义。研究通过定量免疫组化（IHC）和新型酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，揭示了组织PVR表达与血清水平无相关性，但发现PVR高表达与透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的转移进展和不良预后显著相关，为PVR作为预后生物标志物和免疫治疗新靶点（如联合PD-1抑制剂）提供了关键证据。
引言
免疫检查点抑制剂（ICIs），特别是靶向PD-1/PD-L1轴的药物，已经显著改善了一部分癌症患者的预后。然而，预测哪些患者能够从这些疗法中获益仍然是一个主要的临床挑战。目前，PD-L1的免疫组织化学（IHC）检测是最广泛使用的生物标志物，但其应用存在明显的局限性，例如不同商业检测试剂盒的差异、缺乏标准化的临界值、血清与血浆样本的区别，以及区分可溶性蛋白与细胞外囊泡结合形式的困难。这些因素阻碍了其临床转化。
在此背景下，脊髓灰质炎病毒受体（PVR，亦称CD155）作为一个与PD-L1功能相关的免疫检查点配体，因其在多种恶性肿瘤中的广泛表达以及与不良预后的关联而受到关注。与PD-L1类似，PVR也存在膜结合型和分泌型两种形式。PVR通过与其受体相互作用，包括TIGIT、CD96、KIR2DL5A（抑制性）和DNAM-1（激活性），形成了一个复杂的免疫调节轴，目前正处于积极的临床研究阶段。多项正在进行的临床试验正在评估抗TIGIT抗体与其他ICIs的联合疗法。同时，首个靶向PVR的单克隆抗体NTX-1088也正在进行I期临床试验。
膀胱癌和肾细胞癌因其具有免疫活性的肿瘤微环境，是ICI治疗的有前景的适应症。在肾细胞癌中，对TCGA数据库的分析发现，肾乳头状细胞癌（pRCC）和甲状腺癌是PVR mRNA水平升高与不良总生存期关联最强的两种肿瘤类型。在膀胱癌中，尤其是肌层浸润性膀胱癌，PVR表达上调并与侵袭性肿瘤表型和不良预后相关。本研究旨在分析PVR在膀胱癌和肾癌患者肿瘤组织及匹配血液样本中的表达，并探讨其临床意义。
材料与方法
患者样本
研究纳入了110例患者的血清和尿液样本，包括73例膀胱癌患者和37例肾细胞癌患者（其中25例为透明细胞癌，10例为乳头状癌）。所有样本均来自2022年至2023年间就诊于里耶卡临床医院中心的患者。此外，还包含了2013年至2015年间诊断的95例仅存组织的ccRCC活检样本，构成了一个扩展的ccRCC队列（总计118例）。对照组包括100名健康个体的血清样本和15名无恶性肿瘤病史患者的尿液样本。所有组织样本均来自福尔马林固定石蜡包埋的存档材料。
可溶性PVR检测ELISA方法的开发
研究人员开发了两种定制的ELISA方法。第一种检测针对PVR胞外域，可检测总PVR水平（包括膜结合型和分泌型）。为了特异性检测分泌型PVR异构体，研究人员制备了针对分泌型PVR独特细胞内尾肽的特异性单克隆抗体（克隆sPVRβ-KLH.01），并建立了第二种ELISA。该抗体的特异性通过ELISA和过表达PVR胞外域或分泌型异构体的HEK293细胞的免疫荧光实验进行了验证。为了提高实验间的可重复性，在每个ELISA板上都包含了一个参考血清样本迷你队列进行内部标准化。
组织微阵列制备和免疫组织化学
构建了组织微阵列（TMA），并使用抗PVR抗体（D8A5G）和抗PD-L1抗体（22C3）进行免疫组化染色。PVR表达通过H-score进行量化，该积分综合了染色强度和阳性肿瘤细胞的百分比。将H-score ≥10定义为PVR阳性，H-score ≥70定义为PVR高表达。PD-L1表达则通过肿瘤比例评分（TPS）进行评估。
统计分析
使用R软件进行统计分析。定性数据采用Fisher精确检验进行比较。定量数据采用Mann-Whitney U检验（两组比较）或Kruskal-Wallis检验（多组比较）。生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
结果
循环和组织内PVR表达
研究发现，与健康对照组相比，膀胱癌和肾癌患者的血清PVR水平均显著升高。然而，患者与对照组个体间存在显著的变异重叠，限制了其诊断精确性。尿液中也检测到PVR，但其水平较低且变异性更大，可靠性不如血清。
通过免疫组化分析发现，膀胱癌和肾癌肿瘤组织的PVR H-score分布范围很广。然而，无论是总PVR还是分泌型PVR特异的血清水平，均与匹配肿瘤组织的H-score无显著相关性。将膜表达和胞浆表达分开分析后，同样未发现与血清PVR的相关性。这表明循环中的PVR和组织中的PVR反映了不同的生物学实体。
分泌型PVR特异性ELISA的验证
研究人员成功开发并验证了分泌型PVR特异性ELISA。该检测方法使用的单克隆抗体sPVRβ-KLH.01能够特异性识别分泌型PVR，而在非透膜条件下无法识别PVR胞外域。总PVR ELISA和分泌型PVR特异性ELISA在血清样本中的检测结果存在相关性，但两者均与肿瘤组织的PVR表达无关，这与PD-L1的研究发现一致。
PVR组织表达与临床病理特征的关系
在膀胱癌中，较高的PVR表达与肿瘤分级和淋巴血管浸润显著相关。在肾癌中，PVR表达表现出明显的亚型特异性。所有乳头状肾细胞癌（pRCC）肿瘤的PVR表达均高于阴性临界值，而绝大多数透明细胞肾细胞癌（ccRCC）肿瘤的PVR表达低于该临界值。值得注意的是，在初始队列中，两例PVR阳性的ccRCC患者（H-score ≥70）均发生了转移，提示PVR阳性可能与ccRCC的侵袭性疾病相关。
PVR表达与ccRCC转移进展和生存的关系
在扩展的ccRCC队列中，转移性疾病的PVR表达显著高于非转移性疾病。尽管ccRCC中PVR表达普遍较低，但所有具有高PVR H-score的病例均发生了转移。根据转移发生时间进行分层分析显示，在随访期间进展为转移性疾病的患者中，PVR表达最高。这表明高PVR表达可能预测未来的转移进展。
生存分析显示，在96个月的随访期内，PVR阳性（H-score ≥10）的ccRCC患者的总生存期显著缩短。将H-score作为连续变量进行分析时，未发现与总生存期的显著线性关联，表明PVR的影响可能是阈值依赖性的，而非剂量依赖性的。
研究人员同时分析了PD-L1表达。只有一小部分肾癌肿瘤表达PD-L1，并且两名PD-L1高表达的患者也同时是PVR阳性。然而，PD-L1高表达与转移发展无关。
讨论
本研究首次在膀胱癌和肾癌中对组织和匹配血清中的PVR进行了整合分析，并使用了新开发的异构体特异性检测工具。研究证实PVR在组织和循环中均上调，但两者不相关。研究还揭示了一个显著的肿瘤亚型特异性模式：pRCC表现出持续的高PVR表达，而ccRCC通常为低表达，除了一小部分具有侵袭性、转移性的病例。
PVR与PD-L1共表达在某些肿瘤中已被确定为独立的预后因素，这提示某些患者可能从基于ICI的联合治疗策略中获益。所有pRCC病例均呈PVR阳性，提示该亚型可能是一个可靶向的群体。pRCC通常由MET激活驱动，而HGF-MET信号通路已被证明可调节PVR水平并促进侵袭性细胞程序，这可能是该亚型中PVR一致性阳性的潜在机制。
ccRCC的独特之处在于，尽管其肿瘤突变负荷（TMB）较低，但转移性ccRCC仍对ICI有反应。来自人类蛋白质图谱的数据显示，PVR的激活受体DNAM-1在ccRCC中具有显著的预后价值，高DNAM-1表达与良好的预后相关。PVR可以抵消DNAM-1的作用，而肾细胞癌可通过下调DNAM-1来逃避免疫监视。这些发现为在转移性ccRCC中进一步研究PVR提供了强有力的理论依据，PVR不仅可能作为生物标志物，也可能是免疫逃逸的驱动因素。
本研究的局限性包括相对较小的队列规模和单中心设计。
结论
本研究强调了PVR复杂的生物学特性。组织学分析揭示了亚型特异性的PVR模式，其中ccRCC病例的高瘤内PVR表达与转移持续相关，表明其可能代表一种侵袭性表型。这些发现凸显了组织PVR作为患者分层和治疗选择中互补性生物标志物的潜力，特别是在抗PVR疗法临床研发不断推进的背景下。
