《Frontiers in Human Neuroscience》：Thalamic GABA+ levels are negatively associated with neuropsychiatric symptoms in patients with insomnia
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本研究采用磁共振波谱(MRS)技术，发现失眠患者丘脑区γ-氨基丁酸(GABA+)水平显著降低，且与疲劳严重程度量表(FSS)和贝克焦虑量表(BAI)评分呈负相关。研究首次揭示丘脑代谢物改变与失眠患者神经精神症状的关联，为失眠的病理生理机制提供了客观神经化学证据。
引言
充足睡眠质量对身体健康至关重要，而睡眠质量不足会产生有害的健康影响。美国睡眠基金会建议成年人每晚保持7-9小时睡眠，美国心脏协会和疾病控制与预防中心也提倡成年人每晚至少睡7小时以促进最佳健康状态并降低疾病风险。失眠是最常见的睡眠障碍类型，根据《国际睡眠障碍分类第三版》(ICSD-3)的诊断标准，失眠诊断必须满足三个条件：持续的睡眠困难、充足的睡眠机会以及相关的日间功能损害。研究表明，失眠患者面临发展和维持各种精神疾病的风险增加，特别是抑郁和焦虑。此外，失眠还会增加心血管疾病、肥胖和糖尿病的风险。
在现代社会的快节奏生活方式中，日益增加的压力水平使失眠成为普遍存在的公共卫生问题。中国家庭追踪研究的全国代表性统计数据显示，成年人的平均睡眠时间从2010年到2016年略有下降，但从2016年到2018年保持相对稳定。除了引起疲劳、疲倦、注意力和动机下降外，失眠还可能导致焦虑和抑郁、社交和职业功能受损以及错误或事故的发生。
尽管睡眠是基本的生理功能，但其机制相当复杂。研究表明，多个脑区参与促进睡眠，其中丘脑在睡眠调节中起着关键作用。丘脑是参与睡眠-觉醒周期、超兴奋、情绪以及恢复性自主神经和内分泌过程病理生理的关键脑区域。通过丘脑皮质回路，丘脑通过调节皮质兴奋性和感觉信息传递，影响睡眠的启动和维持。因此，在本研究中，选择丘脑作为感兴趣区域，因为其功能障碍可能与失眠的神经生物学机制有关。
材料与方法
参与者
共招募41名参与者，包括20名失眠患者和21名年龄性别匹配的健康对照。失眠患者（年龄19-39岁）根据ICSD-3标准在厦门医学院第二附属医院神经内科诊断，而健康对照（年龄20-40岁）无睡眠障碍史。失眠诊断要求存在持续>3个月的睡眠困难、入睡困难（夜间卧床入睡时间>30分钟）以及相关的日间功能损害。所有参与者均为新诊断病例，未服用任何失眠症状药物，症状平均持续1.5年。
排除标准包括：神经、内分泌或精神疾病；常规脑异常（如肿瘤、出血、梗死）；酒精或物质滥用；以及磁共振成像(MRI)禁忌症（如金属植入物、起搏器、神经刺激器、身体穿孔或幽闭恐惧症）。所有参与者在代谢物测量和量表评估前需停止使用任何改善睡眠质量的药物，并至少提前24小时避免摄入含咖啡因物质。
磁共振数据采集
所有MRI和MRS检查均在临床3.0-T MRI扫描仪上进行，配备24通道头线圈。在MRS检查前进行常规MRI扫描以排除颅内病变。采集的图像和扫描参数包括：轴位T2加权快速自旋回波图像、冠状位T2加权液体衰减反转恢复(T2 FLAIR)图像和矢状位T2 FLAIR图像。
常规MRS和MEGA-PRESS图像采集
为避免扫描过程中颅骨、窦结构和脑脊液的潜在干扰，优化了体素大小，选择右侧丘脑20×20×20 mm3的兴趣体积(VOI)。MRS扫描参数如下：重复时间(TR)=3,000 ms，回波时间(TE)=35 ms；信号平均次数=128；采集时间=7分钟36秒。对于Mescher-Garwood点分辨波谱(MEGA-PRESS)，扫描参数如下：VOI=20×20×20 mm3；TR=1,800 ms，TE=68 ms；谱宽=2,000 Hz；数据点=2,048；信号平均次数=160；采集时间=10分钟19秒；总扫描时间≤20分钟。
光谱质量控制
光谱在GABA+的Cramér-Rao下界(CRLB)超过20%或信噪比(SNR)低于10时被排除。平均光谱质量指标为：SNR=18.2±3.4（失眠组）vs. 19.1±2.8（对照组）；平均半高全宽(FWHM)=0.065±0.012 ppm；采集过程中频率漂移<0.5 ppm。没有参与者基于这些质量控制标准被排除。需要注意的是，"GABA+"指的是GABA加上在3 ppm处共同编辑的大分子贡献，这是没有大分子抑制的MEGA-PRESS的标准做法。大分子组分估计约占GABA+总信号的40-60%。
量表调查
使用卡罗林斯卡嗜睡量表(KSS)评估参与者的主观疲倦程度。该量表通过9点评分系统量化即时警觉性/嗜睡状态，分数范围从1（极度警觉）到9（极度困倦）。使用贝克焦虑量表(BAI)评估参与者焦虑症状的严重程度，并区分焦虑和抑郁症状。BAI包含21个项目，每个描述特定的焦虑症状。总分范围0-63分，0-7分属于正常范围，8-15分表示可能轻度焦虑，16-25分提示中度焦虑，26-63分表示严重焦虑。疲劳严重程度量表(FSS)是广泛使用的主观评估工具，用于评估个体对疲劳的主观感知及其对日常功能的影响。它评估过去2周的疲劳状态，分数越高表明疲劳的严重程度、频率和对日常生活的影响越大，显著影响日常功能。
MRS数据分析
使用线性组合模型(LCModel)作为MRS数据分析的关键方法，旨在从复杂的光谱信号中量化各种代谢物的浓度。使用LCModel（版本6.3-1R）光谱分析软件进行检测到的脑代谢物的量化。量化基于线性组合模型和模拟基组（包括Gln、Glu、N-乙酰天门冬氨酸和N-乙酰天门冬酰谷氨酸的基谱）。水信号参考的代谢物浓度从编辑光谱计算。由于MEGA-PRESS序列中J耦合效应和T2衰减的影响等因素，获得的绝对值可能包含未知的缩放因子，不是绝对定量值。
统计分析
使用IBM SPSS Statistics（版本27.0）和GraphPad Prism（版本10.3.1）进行数据分析和可视化。使用SPSS对人口统计学特征、脑内代谢物浓度以及ESS、FSS和BAI评分进行统计分析，同时使用GraphPad Prism生成统计图。首先使用单样本Kolmogorov-Smirnov(K-S)检验评估总队列和亚组中连续变量的正态性。符合正态分布的代谢物数据使用独立样本t检验在健康对照组和失眠患者组之间进行比较，并以均值±标准差(SD)表示。对于非正态分布数据，使用Mann-Whitney U检验进行组间比较，结果以中位数（四分位距）呈现。显著性水平设定为p<0.05。为控制年龄和性别等协变量的影响，当因变量满足正态性假设时采用协方差分析(ANCOVA)，而对非正态分布数据应用Quade's ANCOVA。
结果
参与者特征
在控制年龄和性别后，协方差分析显示失眠组的FSS评分显著高于对照组[F(1,36)=150.25，p<0.01]。对非正态分布的KSS评分进行的基于等级的协方差分析同样表明失眠组评分显著高于对照组[F(1,37)=136.33，p<0.001]。在男性参与者中，失眠组的BAI评分显著高于对照组(p<0.001)。此外，观察到组别和年龄之间存在边际显著的交互作用[F(2,35)=2.63，p=0.086]，表明年龄对焦虑的影响可能在不同组别间存在差异。
丘脑神经代谢物差异
与健康对照组（均值±标准差：3.056±0.715）相比，失眠组表现出显著较低的丘脑GABA+水平（2.623±0.468；p=0.027）。相反，失眠组的丘脑GPC浓度较高（2.282±0.166 vs. 对照组2.055±0.172；p<0.001），GPC+PCh（2.282±0.166 vs. 2.102±0.180；p=0.002）和Cr+PCr（8.294±0.467 vs. 7.832±0.485；p=0.003）也较高。尽管失眠组患者的Glu水平略高于健康对照组，但差异无统计学意义(p=0.962)。值得注意的是，其他测量的代谢物未发现改变。
计算了显著代谢物差异的效应大小及95%置信区间：GABA+组间差异：Cohen's d=0.72 [95% CI: 0.08-1.35]；GPC组间差异：Cohen's d=1.35 [95% CI: 0.66-2.02]；Cr+PCr组间差异：Cohen's d=0.98 [95% CI: 0.32-1.63]。在对10种代谢物进行多重比较的错误发现率(FDR)校正后，GABA+(pFDR=0.045)、GPC(pFDR=0.003)和Cr+PCr(pFDR=0.015)仍然具有统计学显著性。
脑代谢物与主观量表评分的相关性分析
为评估失眠患者脑代谢物与其焦虑、主观嗜睡和疲劳水平之间的潜在联系，采用了基于残差的回归方法控制年龄和性别，从而获得更精确的估计，尽管组间人口统计学特征无显著差异。分析显示GABA+水平与FSS评分呈显著负相关(r=-0.656，p=0.003)。此外，丘脑GABA+浓度与BAI评分呈显著负相关(r=-0.467，p=0.038)，虽然与KSS呈负相关趋势，但未达到统计学显著性(r=-0.419，p=0.066)。
相关性系数的置信区间如下：GABA+–FSS：r=-0.656 [95% CI: -0.86至-0.30]；GABA+–BAI：r=-0.467 [95% CI: -0.75至-0.05]；GABA+–KSS：r=-0.419 [95% CI: -0.71至0.03]。KSS相关性未达到统计学显著性(p=0.066)，应解释为需要更大样本确认的趋势水平关联。
讨论
本研究确定了失眠患者与健康对照组之间丘脑代谢物水平的差异。与对照组相比，失眠组表现出较低的GABA+水平，这与之前的观察结果一致。相反，Morgan等人报告原发性失眠患者的枕叶GABA+水平高于对照组。此外，本研究揭示了GABA+水平与焦虑、疲劳和主观嗜睡评分呈负相关。良好的睡眠质量对心理健康至关重要，有说服力的证据表明失眠经常与各种精神疾病共同发生。焦虑障碍患者通常表现出较低的脑GABA+水平。许多抗焦虑药物，如苯二氮卓类药物，通过增强GABA能活性发挥治疗作用。GABA能神经传递密切参与焦虑调节。在本研究中，较低的GABA+水平与焦虑和疲劳相关。
GABA+解释的方法学考虑：需要注意的是，没有大分子抑制的MEGA-PRESS产生"GABA+"，包括在3 ppm处共同编辑的大分子贡献（估计约占总信号的40-60%）。因此，我们的发现反映了复合GABA+信号的改变，而不是纯GABA+浓度。虽然降低的GABA+与减弱的GABA能张力一致，但我们不能排除大分子变化也导致观察到的组间差异的可能性。未来研究需要使用大分子抑制序列（如MEGA-SPECIAL）来分离纯GABA信号。
多项研究表明GABA在促进睡眠和减轻压力中发挥作用。GABA+水平的改变与疲劳，特别是慢性疲劳密切相关，证实了GABA在睡眠中的关键作用。研究表明睡眠-觉醒周期与脑中Glu水平的动态变化密切相关。一项研究发现非快速眼动睡眠期间内侧前额叶皮层Glu水平未能降低可能导致短暂性失眠。这表明睡眠不足会破坏Glu的正常代谢过程，从而干扰睡眠维持。然而，在本研究中，失眠组和对照组之间丘脑Glu水平未观察到统计学显著差异。
我们研究中缺乏显著的谷氨酸改变值得进一步考虑。与之前一些报告失眠中谷氨酸水平改变的研究相反，我们发现组间丘脑Glu浓度无显著差异。这种差异可能反映了区域特异性，因为先前研究检查的是前额叶区域而非丘脑。此外，谷氨酸改变可能在特定睡眠阶段或急性睡眠剥夺后更为明显，而不是在此处检查的慢性失眠状态中。兴奋性和抑制性神经传递之间的平衡，而不是单独的绝对Glu水平，可能与失眠的病理生理学更相关。
相反，失眠组的GPC和Cr+PCr水平均高于对照组。GPC与失眠之间可能存在潜在关联，尽管迄今为止尚无研究直接探讨GPC与失眠的关系。GPC是一种胆碱化合物，是大脑中乙酰胆碱的前体，在神经系统功能中发挥重要作用。我们假设GPC可能通过影响乙酰胆碱合成间接调节GABA和Glu之间的平衡，从而影响睡眠。睡眠受多种神经递质和代谢过程调节，GPC可能通过其对胆碱能神经递质系统的影响间接影响睡眠质量。胆碱能系统在睡眠调节中起关键作用。然而，需要进一步研究阐明GPC对睡眠的影响。
修订的GPC发现解释：虽然我们观察到失眠组GPC水平升高，但与症状测量缺乏显著相关性以及先前没有直接 linking GPC to insomnia 的研究限制了我们得出明确结论的能力。升高的GPC可能反映了改变的膜磷脂代谢或胆碱能活性，但这种解释仍然是推测性的。需要专门设计研究失眠中胆碱化合物作用的研究才能得出机制性结论。
在本研究中，MRS衍生的Cr+PCr水平反映了总肌酸(tCr)水平，因为常规MRS无法区分Cr和PCr。两种形式在细胞能量代谢中起关键作用，特别是在大脑和肌肉中，它们通过肌酸激酶系统参与能量缓冲和运输。一项针对健康成年人的初步研究表明，24小时睡眠剥夺显著增加血清肌酸水平，表明睡眠不足可能改变肌酸代谢。另一项使用31P-MRS的研究调查了30名健康个体在清醒和小睡期间的定量PCr水平，发现左丘脑PCr水平在清醒期间下降，小睡后增加。这一发现支持了PCr水平与警觉程度相关的假设。尽管目前没有关于睡眠与tCr水平关系的直接数据，但可以推测睡眠通过多种途径影响tCr水平。
局限性
本研究存在几个局限性。首先，适中的样本量(n=41)限制了统计功效，特别是对于相关性分析。GABA+与KSS之间的趋势水平关联(r=-0.419，p=0.066)应谨慎解释，并需要在更大队列中确认。事后功效分析表明，以80%功效检测r=0.40的相关性需要每组约46名参与者。
其次，本研究未进行组织分数校正（GM/WM/CSF分割）。丘脑VOI内GM/WM/CSF比例的变化可能导致代谢物估计的个体间变异性。未来研究应纳入基于分割的部分体积校正以提高量化准确性。
第三，我们关注右侧丘脑排除了评估代谢物改变中潜在半球差异的可能性。未来需要双侧MRS研究来调查左丘脑是否发生类似变化。
第四，缺乏客观睡眠测量（如多导睡眠图(PSG)或活动记录仪）限制了我们研究结果的解释性。虽然所有患者基于临床评估和标准化问卷符合ICSD-3失眠诊断标准，但缺乏客观睡眠架构数据排除了评估神经代谢物改变与特定睡眠参数（如睡眠效率、入睡后觉醒时间、慢波睡眠持续时间）之间关系的可能性。未来结合PSG的研究将实现更精确的表型分析。
第五，我们的发现需要在更大、更多样化的队列中复制，涵盖更广的年龄范围、不同的慢性程度和不同的失眠亚型（如入睡性失眠与睡眠维持性失眠）。
结论
本研究通过定量MRS分析揭示，与健康对照组相比，失眠患者丘脑GABA+水平显著较低，而GPC和Cr+PCr水平显著较高；Glu水平未观察到显著差异。此外，降低的GABA+水平与更严重的焦虑症状、日间嗜睡和疲劳直接相关，为失眠的病理生理机制提供了客观神经化学证据。然而，目前关于GPC对睡眠直接影响的研究仍然有限，GPC在睡眠调节中的作用需要进一步研究。未来工作应探索针对GABA能系统的干预措施，以改善失眠患者的临床症状。此外，需要大规模研究验证当前发现，并进一步评估睡眠干预在失眠治疗中的临床潜力。
