《Frontiers in Plant Science》：Increasing dissolved oxygen in water enhances the flooding tolerance of Carya illinoinensis
1 Introduction
全球变暖导致洪水事件频发，对全球许多生态系统构成淹没威胁。这些洪水事件是植物的主要非生物胁迫之一，显著影响植物物种的全球分布、群落组成、结构和动态。研究表明，淹水条件下植物受损的主要原因不是水的存在本身，而是土壤氧气可用性急剧下降导致的低氧胁迫。氧气在能量代谢和氧化磷酸化等关键生理过程中起着至关重要的作用，其可用性直接影响植物生存。然而，氧气在水中的溶解度极低，其扩散速率显著慢于空气。因此，即使是溶解氧饱和的水中，陆生植物也会面临严重的氧气短缺。
根据对水分条件的适应性，陆生植物可分为三大类：旱生植物、中生植物和水生植物。其中，中生植物种类繁多、分布广泛，是河岸生态系统的关键组成部分。与适应水环境的水生植物不同，中生植物长期生长在富氧的陆地环境中。它们的叶片和茎通常具有蜡质角质层、发达的表皮层和致密的细胞结构。然而，在淹水条件下，这些结构会阻碍氧气扩散到植物体内，加剧缺氧。虽然低氧胁迫会损害光合作用、能量生产和养分吸收等基本生理功能，最终阻碍植物生长，降低产量和品质，但为了应对这种胁迫，植物在长期进化过程中形成了多种抵御低氧的防御机制。这些策略包括高度和地径的变化、光合产物分配和积累的变化以及抗氧化系统的增强，共同提高了它们对低氧环境的适应性。
具体而言，植物表型性状是对非生物胁迫的主要可见响应。研究表明，低氧会抑制新叶形成，导致叶片失绿和脱落，从而限制植物的整体生长。植物也可能通过形成通气组织来改善根系内部的氧气平衡。仅靠形态观察难以阐明潜在的生理机制；必须辅以关键化学和生理指标的分析。丙二醛含量是膜脂过氧化的关键指标，直接反映了细胞膜的氧化损伤程度。此外，植物利用渗透调节物质和抗氧化酶系统协同作用，以解毒过量的活性氧并改善胁迫适应。需要注意的是，这些适应策略的有效性通常受到淹水持续时间和植物品种的显著调节。
美国山核桃是胡桃科的一种落叶坚果树。就木材价值而言，美国山核桃是与黑胡桃和欧洲稠李齐名的三大最佳硬木树种之一。该物种原产于墨西哥和美国，但已在加拿大、意大利、巴西、法国、以色列、南非、日本和中国等多个国家进行商业栽培。在中国，特别是在长江三角洲地区，已经建立了大规模的美洲山核桃示范点。然而，该地区受长江高水位影响，洪水频发。因此，研究和保护美国山核桃，特别是探索增强其耐低氧环境的方法具有重要意义。
近期研究已证实美国山核桃具有一定的耐淹能力。然而，现有研究主要集中在其对低氧胁迫的生理响应上。目前尚不清楚主动提高淹水中的溶解氧浓度是否能增强这种耐受性，以及这种增强是否因品种而异。为了填补这一空白，本研究实施了一种以主动提高淹水溶解氧为核心的环境调控策略。我们系统评估了这种干预措施对两个主要美国山核桃品种‘Mahan’和‘Pawnee’耐淹性的效果。我们假设：（1）提高淹水溶解氧将减轻形态损伤（降低叶片损伤率和损伤指数）和生长抑制；（2）它将通过减少氧化损伤（降低MDA）和调节相关的渗透调节和抗氧化酶适应性反应来缓解生理胁迫；（3）增加溶解氧对整体耐淹性的改善程度将表现出明显的品种特异性。
2 Materials and methods
2.1 Plant materials
实验材料为一年生美国山核桃幼苗，包括来自长江三角洲地区的两个主要品种：‘Mahan’和‘Pawnee’。所有幼苗均来自江苏省句容市后白镇张庙村美国山核桃试验基地。盆栽容器为黑色加仑盆（上口径16厘米×下口径12厘米×高30厘米），每个盆装土至离盆沿2厘米处。培养基质为园土、蚯蚓土和有机肥按3:6:1的比例均匀混合。土壤pH值为5.5，田间持水量为31.05%，有机质比例为2.83%，速效氮、磷、钾含量分别为121.25、51.18和93.29毫克/千克。
2.2 Experimental design
2021年6月，选择生长一致（约40厘米高）的幼苗，在南京林业大学下蜀林场具有遮荫功能的温室中驯化15天。整个实验期间，温室温度范围为23.5至34.0°C，相对湿度范围为63.42%至84.97%。实验设计采用随机区组的3×2因子方案，包括三个处理（田间持水量75%、高氧淹水和低氧淹水）和两个品种（‘Mahan’和‘Pawnee’）。六个处理组合各重复三次（n=3），每个重复为一个包含三株幼苗的实验单元。因此，每个处理组合包括9株幼苗（3个重复×3株幼苗），总共54株幼苗。
在实验开始前，所有幼苗均浇水至开始渗漏，然后让其排水。一旦排水停止，表明土壤已达到田间持水量，立即称量对照组每株幼苗的初始重量以建立基线，并开始淹水处理。CK组通过每日称重和补充浇水维持在75%田间持水量。高氧和低氧淹水处理均在低密度聚乙烯树脂缸（56厘米×56厘米×80厘米）中进行，水位维持在根颈以上30厘米。整个实验期间不换水。在HO组中，使用气泵耦合纳米曝气石进行连续曝气，以维持高溶解氧环境。相比之下，LO组仅依靠静态淹水通过水-气交换来模拟自然的低氧淹水条件。
HO处理与LO处理的主要区别在于溶解氧浓度。HO处理维持的平均溶解氧浓度为7.11 ± 0.10 mg L-1，而LO处理平均为1.88 ± 0.09 mg L-1。所有其他水质参数（温度、pH、浊度）在处理间保持一致，使用Hydrolab多参数水质分析仪连续监测。
2.3 Determination of morphological indicators
形态指标，包括叶片数、损伤数、损伤等级、损伤率和损伤指数，分别在第15、30、45和60天记录。
通过人工计数记录幼苗的叶片数和损伤数。损伤等级的分类基于Zhou等人（2019）的方法并稍作调整。1级：叶片卷曲但仍为绿色；2级：叶片变黄；3级：叶片出现深褐色斑块；4级：叶片焦枯并部分脱落。
损伤率和损伤指数分别通过公式1和公式2计算得出。
2.4 Determination of growth indicators
用卷尺测定苗高，用游标卡尺测量地径。与形态指标类似，分别在第0、15、30、45和60天记录幼苗的高度和地径。因此，根据公式3计算株高和地径的生长速率。
在实验结束时（第60天）挖出所有幼苗测定生物量。将美国山核桃幼苗整体挖出，分为三部分（根、茎、叶），洗净后在80°C下烘干至恒重，分别测定三部分的干重。根据公式4计算根冠比。
2.5 Determination of physiological and biochemical indicators
在第15、30、45和60天采集幼苗中部的成熟叶片。部分叶片用于测定质膜透性，其余储存在-80°C超低温冰箱中用于测定其他生理指标。
丙二醛含量采用硫代巴比妥酸试剂法测定，根据Wassie等人（2019）的方法，在100°C下煮沸20分钟。溶液冷却至室温后，以3000 rpm离心10分钟。使用分光光度计在450、532和600 nm波长下测量上清液的吸光度。根据公式5估算MDA浓度。
可溶性蛋白含量通过考马斯亮蓝G-250染色法测定。称取0.1克叶片，用研钵加入1毫升磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.8）研磨，然后转移到10毫升离心管中。用2毫升PBS洗涤研钵两次，合并洗涤液到离心管中，在4°C下以10,000 rpm离心15分钟。离心后，取0.1毫升上清液转移到试管中，加入5毫升考马斯亮蓝G-250并充分混合。两分钟后，使用分光光度计在595 nm波长下测量所得溶液的吸光度。根据公式6计算可溶性蛋白含量。
超氧化物歧化酶活性通过氮蓝四唑还原法测定。酶液制备：称取0.5克叶片于研钵中，加入10毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.8），在4°C下加入少量石英砂研磨成匀浆。将匀浆转移到离心管中，以12,000 rpm在4°C下离心20分钟。上清液即为SOD粗酶液。反应液由14.5 mM甲硫氨酸溶液、3 mM乙二胺四乙酸二钠盐溶液、60 μM核黄素溶液和2.25 mM NBT溶液组成。随后，取2.9毫升反应混合物和0.1毫升酶液加入试管。同时准备两个对照管，一个含2.9毫升反应混合物和0.1毫升PBS（无酶液）作为最大光还原管，另一个含2.9毫升反应混合物和0.1毫升PBS并用锡箔包裹避光。然后将试管置于25°C、4000勒克斯的光照培养箱中20分钟，再置于黑暗中终止反应。反应后，用未照光的对照管将分光光度计调零，分别在560 nm波长下测量各管的吸光度。一个SOD活性单位定义为抑制NBT还原50%的酶量。根据公式7计算SOD活性。
过氧化氢酶活性采用紫外吸收法测定。酶提取：称取0.5克叶片于研钵中，加入2-3毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.8），在4°C下加入少量石英砂研磨成匀浆。将匀浆转移到25毫升容量瓶中，用缓冲液冲洗研钵数次并定容至刻度。随后，将容量瓶置于5°C冰箱中10分钟，上清液以4000 rpm离心15分钟。上清液即为CAT粗酶液。酶活性测定：使用三个10毫升试管（两个用于样品测定，一个作为空白），分别标记为S0、S1和S2，分别加入0.2毫升粗酶液、1.5毫升磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.8）和1.0毫升蒸馏水。将试管S0在沸水浴中加热1分钟以使酶液失活，然后冷却。将所有试管在25°C下预热，然后依次加入0.3毫升0.1 mol/L H2O2。每管快速计时并迅速倒入石英比色皿中，在240 nm波长下测量吸光度，每隔1分钟读数一次，持续4分钟。所有三管测量完毕后，计算酶活性。一个CAT活性单位定义为每分钟240 nm吸光度的变化值。使用公式8和公式9计算CAT活性。
2.6 Statistical analysis
实验数据使用SPSS 20.0软件进行初步统计分析和多变量方差分析的受试者间效应检验。事后比较采用Tukey's HSD检验，置信水平为95%，统计学显著性定义为p<0.05。数据以平均值±标准差表示。
耐淹性综合评价采用Liang等人（2025）描述的隶属函数法。该分析基于淹水胁迫60天后测量的关键形态、生长和生理指标。为消除品种间固有性状差异的影响，首先使用公式10分别计算每个品种各指标的耐性系数。
然后计算每个品种各指标的隶属函数值。这些值的平均值用于比较，D值越高表示该品种的综合抗逆性越强。
最后，根据公式13计算每个处理-品种组合的综合评价值（D值），用于对所有处理-品种组合进行排序。
3 Results
3.1 Morphology indicators of C. illinoinensis under different treatments
3.1.1 Injury numbers and injury grades
对于HO处理下的‘Mahan’品种，损伤数从第15天的2株（均为1级）逐渐增加到第60天的8株（1-4级）。相比之下，LO处理下的损伤更为严重，早在第15天就有4株植株受损（1-2级），到第60天增至9株（1-4级）。
‘Pawnee’品种表现出相似的趋势，但总体损伤严重程度高于‘Mahan’。在HO处理下，其损伤数从第15天的3株（1-2级）增加到第60天的9株（1-3级）。在LO处理下，第15天已有6株植株受损（1-2级），到第60天达到9株（2-4级）。
相比之下，两个品种的CK组在整个试验期间叶片生长健壮，未观察到损伤症状。因此，损伤数和损伤等级均为零。在整个60天的实验期间，两个品种在LO处理下的损伤数始终高于HO处理。并且，在LO处理下，较高损伤等级（3-4级）的植株出现更早且占比更大。
3.1.2 Injury rate and injury index
基于损伤数、损伤等级和幼苗总数，计算了损伤率和损伤指数，分别反映淹水损害的程度和强度。‘Mahan’的损伤率在HO和LO处理下在整个实验期间持续增加，HO组的数值始终低于LO组。相比之下，‘Pawnee’的损伤率增加更快，在HO处理下第60天达到100%，而在LO处理下早在第30天就达到100%。
损伤指数也观察到类似的趋势。除了HO处理下的‘Mahan’在第15天和第30天保持相同的损伤指数（0.222）外，所有其他处理组合的损伤指数随时间推移均呈现渐进式增加。此外，两个品种在HO处理下的损伤指数值始终低于LO处理。总体而言，在相同处理条件下，‘Pawnee’在整个实验期间表现出比‘Mahan’更高的损伤率和损伤指数。
3.2 Growth indicators of C. illinoinensis under different treatments
3.2.1 Height and ground diameter
关于株高生长速率，品种、时间和处理的三因素交互作用不显著。然而，三个主因素（品种、时间和处理）及其两因素交互作用对GRH有显著影响。对于地径生长速率，品种、时间和处理的主效应以及它们的所有交互作用均表现出高度显著的影响。
随着淹水时间的延长，‘Mahan’和‘Pawnee’两个品种在HO和LO处理下的GRH持续下降。具体而言，对于‘Mahan’，在HO处理下所有时间的GRH相对于CK下降了53.41%–85.90%，在LO处理下下降了53.41%–88.46%。类似地，‘Pawnee’表现出明显的下降趋势，与CK相比，HO条件下的GRH降低了71.76%–94.32%，LO条件下降低了72.94%–94.32%。这些结果表明HO和LO处理均显著抑制了幼苗的株高生长。
对于GRD，两个品种在HO和LO淹水处理下的值均显著高于CK，并且LO处理 consistently 导致比HO处理更大的GRD。具体而言，‘Mahan’在45-60天期间达到最大GRD（HO：0.15毫米；LO：0.22毫米），而其最小值记录在15-30天期间（HO：0.11毫米；LO：0.14毫米）。类似地，‘Pawnee’在45-60天达到最大GRD（HO：0.32毫米；LO：0.39毫米），最小值出现在最初的0-15天（HO：0.10毫米；LO：0.15毫米）。
总体而言，在整个60天的实验期间，两个品种的株高生长速率顺序为：CK > HO > LO。具体而言，在CK条件下，‘Pawnee’表现出比‘Mahan’更高的GRH，而在HO和LO淹水处理下，‘Mahan’表现出更优的GRH。相比之下，两个品种的GRD大体遵循CK < HO < LO的模式。在这些淹水处理下，‘Pawnee’表现出比‘Mahan’更大的GRD，突出了品种对处理的特异性响应。
3.2.2 Total biomass and root to shoot ratio
处理间总生物量存在显著差异。同样，根冠比在处理间也存在显著差异，在品种间也存在显著差异。处理×品种的交互作用对TB和RSR均不显著。
在收获时（第60天），观察到HO处理对两个品种均有显著的生长促进作用。具体而言，对于‘Mahan’，HO处理下的TB和RSR分别达到11.12克和1.17，显著高于CK和LO处理。对于‘Pawnee’，HO处理下的TB比CK增加了22.31%。该品种的最高RSR也出现在HO处理下（1.12），其次是CK（1.01），LO处理的值最低（0.83）。
3.3 Physiological indicators of C. illinoinensis under different treatments
3.3.1 Malondialdhyde
MDA含量受到品种、时间、处理及其所有交互作用的显著影响。如图5a所示，两个品种在HO和LO处理下的MDA含量随时间增加，在第60天达到峰值（‘Mahan’：36.77–39.91 μmol·g-1；‘Pawnee’：48.02–51.94 μmol·g-1）。
在‘Mahan’中，LO处理下的MDA含量在所有时间均显著高于CK，增幅为25.35%–53.43%。在HO处理下，MDA含量在第30天和第45天也显著高于CK，分别增加了33.99%和31.10%。值得注意的是，在第15天和第60天，HO处理下的MDA含量显著低于LO处理，分别降低了10.44%和7.86%。
在‘Pawnee’中观察到类似的模式。在整个实验期间，LO和HO处理下的MDA
