Navitoclax与Venetoclax联合多柔比星在三阴性乳腺癌小鼠模型中的差异化疗效及机制研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Differential responses to the combination of navitoclax and venetoclax with doxorubicin in murine models of triple negative breast cancer

本综述系统探讨了BH3模拟物navitoclax（靶向Bcl-2/Bcl-xL）与venetoclax（选择性靶向Bcl-2）作为Senolytics（衰老细胞清除剂），在联合标准化疗药物doxorubicin（多柔比星）治疗三阴性乳腺癌（TNBC）时的差异化响应。研究通过体外细胞模型（4T1, E0771）及免疫健全小鼠体内实验证实，两种药物均可通过清除therapy-induced senescence（TIS，治疗诱导衰老）细胞、促进凋亡并下调衰老相关基因（如CDKN1A/p21Cip1、IL6）表达，有效抑制肿瘤进展，为克服化疗耐药及预防复发提供了新策略。

　　

引言

乳腺癌是全球女性中最常被诊断出的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一。复发，通常由治疗失败引起，是导致乳腺癌死亡率高的重要因素。因此，识别高复发风险的乳腺癌患者并开发更有效的治疗策略对于提高总生存率至关重要。化疗药物耐药性是癌症治疗中的一个核心问题。肿瘤最初可能对治疗有反应，但可以通过多种分子和细胞机制产生耐药性。这些机制包括治疗诱导的选择出能够存活化疗的侵袭性肿瘤细胞亚群。解决癌细胞如何逃避化疗对于提高治疗效果和患者预后至关重要。

治疗诱导衰老（TIS）在肿瘤细胞对抗癌治疗的反应中起着关键作用，无论是在体外还是体内，并被认为是癌症的一个标志。虽然TIS最初可以作为肿瘤生长的屏障，但它越来越多地被认为是一把双刃剑，反映了癌症治疗的不利结果。一个主要的担忧是，一些衰老的肿瘤细胞可以逃脱衰老诱导的生长停滞，演变成更具侵袭性的、干细胞样的变体，这有助于逃避免疫监视，导致肿瘤休眠，并最终导致疾病复发。因此，持续的研究工作集中在开发靶向和消除衰老肿瘤细胞的策略，目的是提高治疗效果。

Senotherapeutics（衰老治疗药物），一类靶向衰老细胞的药物，正在成为潜在的解决方案。这些包括Senolytics（衰老细胞清除剂），它选择性地诱导衰老细胞凋亡；Senomorphics（衰老表型调节剂），它改变衰老相关分泌表型（SASP）；以及Senostatics（衰老稳定剂），它维持生长停滞并防止逃脱衰老。然而，关于它们与诱导衰老的标准化疗联合使用时，其衰老选择性的协同效应仍在讨论中。此外，在癌症模型中，这些不同化合物的有效性存在高度变异性。一个原因可能是用于筛选或测试不同衰老治疗药物的荷瘤动物模型主要依赖于植入免疫缺陷宿主的异种移植瘤。这种方法存在局限性，特别是考虑到SASP与免疫系统相互作用的复杂且有据可查的方式。值得注意的是，在TIS发展后的最初1-3周内，SASP经常引发有助于肿瘤清除的免疫反应。这种现象在乳腺癌（由CDK4/6抑制剂驱动）、肝细胞癌（通过p53诱导的衰老）以及早期肝脏病变（由电离辐射或KRAS^G12V突变诱导）模型中均有观察到。然而，几周后，这种免疫介导的肿瘤生长抑制往往会减弱，使肿瘤有可能再生。为了充分理解诱导衰老（Senogenic）和衰老清除（Senolytic）疗法的最佳利用，需要在免疫健全的动物模型中进行更全面的研究。

Navitoclax和venetoclax都是具有临床实用性的Senolytics notable examples，作为抗血液恶性肿瘤的抗癌剂，包括慢性淋巴细胞白血病（CLL）和急性髓系白血病（AML）。Venetoclax是一种BH3模拟药物，仅靶向Bcl-2，因此其选择性和毒性特征与navitoclax不同。Navitoclax抑制Bcl-2和Bcl-x_L，使其成为一种有效的Senolytic，特别是针对TIS肿瘤细胞。然而，对Bcl-x_L的抑制会导致显著的不良反应，最明显的是血小板减少症，这通常是剂量限制性的，并限制了其临床应用。另一方面，Venetoclax选择性抑制Bcl-2而不影响Bcl-x_L， resulting in a more favorable toxicity profile with a lower risk of thrombocytopenia。尽管Venetoclax现在是治疗Bcl-2依赖性癌症（特别是CLL和AML）的标准护理，但由于其缺乏Bcl-x_L抑制，其对TIS肿瘤细胞的衰老清除效力通常低于navitoclax。不幸的是，关于venetoclax在实体瘤模型中的衰老清除潜力的信息匮乏。在这项工作中，我们评估了navitoclax和venetoclax与多柔比星在两种小鼠三阴性乳腺癌模型中的联合效应，包括体外和一种免疫健全小鼠体内模型。

材料与方法

本研究使用了4T1和E0771小鼠三阴性乳腺癌细胞系。细胞在补充有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。多柔比星盐酸盐、venetoclax和navitoclax购自Selleckchem。药物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中处理。

实验设计采用筛选策略，以确定多柔比星和Senolytics联合诱导治疗诱导衰老细胞死亡的最佳时间点。实验分组包括：无药载体（对照）、多柔比星、venetoclax、navitoclax，以及多柔比星与venetoclax或navitoclax的联合治疗。TIS通过脉冲暴露于1 μM多柔比星2小时来建立。细胞随后用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并更换新鲜培养基。一旦TIS在第3天达到峰值，细胞用venetoclax或navitoclax处理。所有实验均独立重复三次。

通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色和使用C₁₂-FDG的流式细胞术定量来评估衰老。细胞活力使用MTT法测定。凋亡细胞百分比使用FITC Annexin V/7-AAD assay通过流式细胞术测量。使用RT-PCR检测关键衰老相关基因（如CDKN1A, IL6）的表达。利用KMplot数据库分析指示的衰老相关基因的预后意义。在植入E0771细胞的雌性免疫健全C57BL/6小鼠中评估venetoclax或navitoclax对多柔比星治疗后体内肿瘤生长的衰老清除效率。对肿瘤组织进行组织病理学检查和TUNEL assay以评估凋亡。数据以至少三次独立实验的平均值±标准误表示，使用单因素方差分析（ANOVA） followed by Tukey's honest significance test进行统计学分析。

结果

多柔比星在4T1和E0771乳腺癌细胞中诱导衰老

我们首先评估了使用亚致死浓度的多柔比星诱导衰老的情况。4T1和E0771细胞系中TIS的发展基于第3天的SA-β-gal染色以及多柔比星暴露后第1、3、5天基于C₁₂-FDG标记的流式细胞术定量来确认。C₁₂-FDG是SA-β-gal上调的替代指标。结果显示，多柔比星增加了两种细胞系中蓝色染色细胞的数量。在4T1细胞系中，C₁₂-FDG标记细胞的比例在多柔比星处理后的第1、3、5天分别占细胞总数的84.9%、89.7%和81.2%。在E0771细胞系中，C₁₂-FDG标记细胞群在多柔比星暴露后第1天从22.1%增加到第3天的35.9%，并在第5天下降至22.9%。两种细胞系中C₁₂-FDG染色细胞百分比最高的时间点均为第3天（72小时），表明TIS发展的高峰发生在多柔比星处理后72小时。TIS的发展通过CDKN1A表达的增加得到进一步证实，这支持了两种细胞系中DNA损伤触发的细胞周期停滞的诱导。此外，两种细胞系均表现出SASP相关基因IL6的表达增加。

Venetoclax和Navitoclax对多柔比星暴露的4T1和E0771细胞的影响

接下来，评估了双重Bcl-2/Bcl-x_L抑制剂navitoclax和选择性Bcl-2抑制剂venetoclax在治疗24小时后，降低由多柔比星诱导衰老的乳腺肿瘤细胞系活力的能力。测试的BH3模拟物中，除非细胞先前暴露于多柔比星，否则没有一个对肿瘤细胞有实质性影响。Navitoclax和venetoclax都能有效抑制由多柔比星诱导衰老的E0771细胞的生长/活力。然而，只有navitoclax对多柔比星诱导（衰老）的4T1细胞有效，而venetoclax的效果微乎其微（即venetoclax + 多柔比星的效果并不显著大于单独使用多柔比星）。

Navitoclax和Venetoclax与多柔比星的联合应用与差异性促进凋亡相关

在与BH3模拟物相关的前期研究中，其增强化疗敏感性的能力与促进凋亡有关。在E0771细胞中，与对照组相比，多柔比星处理组的凋亡细胞显著增加。单独的venetoclax或navitoclax在未处理的E0771细胞中并未诱导超出对照水平的凋亡。代表性的流式细胞术图表显示，联合治疗组的凋亡细胞群相对于其他实验组有所增加。当venetoclax或navitoclax施用于多柔比星暴露的乳腺肿瘤细胞时，相对于单独使用多柔比星的细胞，E0771细胞中出现了向凋亡的显著转变。4T1细胞的代表性流式细胞术图表显示，对venetoclax治疗有轻微的向凋亡转变的趋势，但navitoclax单独使用则没有。然而，这种转变没有统计学意义。凋亡细胞群的定量显示，与未处理细胞相比，多柔比星处理的细胞中凋亡显著增加。值得注意的是，navitoclax单独使用并未在初始4T1细胞中诱导超出对照细胞的凋亡。然而，当navitoclax应用于多柔比星暴露的4T1细胞时，与单独多柔比星组相比，凋亡细胞百分比增加了约两倍，表明序贯navitoclax暴露（可能在衰老诱导后）增强了凋亡。然而，在venetoclax/多柔比星联合处理组中未检测到凋亡增加，这表明venetoclax未能使4T1细胞增敏。

Navitoclax和Venetoclax与多柔比星的联合应用伴随CDKN1A和IL6表达的降低

使用RT-PCR评估了venetoclax和navitoclax对多柔比星诱导衰老后衰老相关基因CDKN1A和SASP基因IL6的影响。在4T1细胞中，用1 μM多柔比星处理2小时显著上调了CDKN1A表达，相对于未处理细胞超过两倍。Venetoclax或navitoclax单独使用并未改变CDKN1A的表达水平。然而，在多柔比星诱导衰老后使用venetoclax或navitoclax处理，导致CDKN1A表达相较于单独多柔比星处理组显著降低。此外，IL6表达显示出类似的模式，在多柔比星处理后显著上调。两种BH3模拟物均未改变IL6的表达。然而，联合治疗组表现出CDKN1A的显著下调。

在E0771细胞中，多柔比星和navitoclax显著上调了CDKN1A相对于未处理组。在脉冲暴露于多柔比星诱导衰老后，暴露于venetoclax或navitoclax显著抑制了CDKN1A表达，与单独多柔比星相比。此外，IL6表达在多柔比星处理后显著增加。与多柔比星暴露的细胞相比，联合治疗的细胞中IL6表达下调。然而，与venetoclax相比，在用navitoclax处理多柔比星诱导衰老后的细胞中，IL6的下调更为明显。这些结果表明，venetoclax和navitoclax治疗，当用于对抗多柔比星暴露的4T1细胞时，与CDKN1A和IL6表达的降低相关，这可能主要是由于衰老肿瘤细胞负荷的减少。

为了评估CDKN1A和IL6表达谱与复发关联的临床意义，研究了CDKN1A和IL6表达谱对接受化疗的乳腺癌患者无复发生存的影响。使用KMplot工具生成Kaplan-Meier曲线。图示了CDKN1A和IL6表达水平与这些患者无复发生存概率的关联。CDKN1A高表达谱的患者复发可能性比低表达谱患者高30%。类似地，IL6与复发显著相关。

Venetoclax和Navitoclax在免疫健全动物中抑制多柔比星治疗后E0771细胞的生长

基于venetoclax和navitoclax与多柔比星联合在E0771细胞的细胞培养研究中的有效性，我们在免疫健全动物（植入E0771细胞的C57BL/6小鼠）中评估了联合治疗对多柔比星治疗后体内肿瘤生长的作用。肿瘤体积定量结果显示，在第1天和第4天给予两剂多柔比星，相对于未治疗的肿瘤，抑制了肿瘤生长达8天。然而，从第10天开始观察到多柔比星治疗肿瘤的增殖恢复。从第6天开始单独使用四剂venetoclax或navitoclax，对肿瘤生长没有显著影响。然而，两种药物在多柔比星治疗后都显著降低了肿瘤体积，特别是在第12天和第14天。与细胞培养研究显示navitoclax在清除多柔比星暴露的（衰老）癌细胞方面具有优势的发现不同，体内研究结果强调了两种BH3模拟物与多柔比星序贯联合使用时的协同效应，其抗肿瘤功效超过了单独使用多柔比星所观察到的效果。这些数据表明，venetoclax与navitoclax一样，能够在免疫健全小鼠中减少多柔比星治疗后的肿瘤体积。

Venetoclax和Navitoclax促进多柔比星治疗后体内肿瘤凋亡和坏死

肿瘤切片经苏木精和伊红（H&E）染色的组织学分析为了解实验治疗诱导的细胞和形态学变化提供了进一步的信息。未经治疗的皮下肿瘤结节显示排列密集的肿瘤细胞行，细胞核多形性、相对圆形、染色质开放，并伴有丰富的血液供应。根据Evans分级为I级，观察到最小程度的破坏。其他切片显示存在巨噬细胞、出血和含铁血黄素颗粒。多柔比星治疗的肿瘤结节显示肿瘤组织疏松，细胞从圆形、核丰富变为纺锤形、核收缩和拉长。大多数细胞出现退化，导致坏死区域增加，间质增多，并出现用于清除碎片的巨噬细胞。此外，观察到白细胞浸润作为对肿瘤变性的反应。Venetoclax促进了肿瘤细胞的坏死和炎症。Navitoclax治疗的肿瘤结节显示肿瘤细胞与炎症细胞混合，并被血管穿透。大多数细胞显示核溶解。其他切片显示间质沉积增加。所有单药治疗组根据Evans分级被评为IIa级。联合治疗组（多柔比星加venetoclax或navitoclax）显著诱导坏死，间质内炎症细胞较多，与其他治疗组相比，venetoclax的坏死效果更显著。这种破坏相对于对照组和多柔比星治疗组织有显著差异，在所有实验组中具有最高的Evans分级，IIb级。

与组织病理学评估一致，使用TUNEL assay检测肿瘤组织的凋亡。显微图像表明，用多柔比星诱导衰老的肿瘤细胞经venetoclax或navitoclax处理后，与相应的单药治疗组相比，显示出明显的凋亡证据。未处理的肿瘤细胞显示最小的荧光强度，表明没有凋亡活动。这些发现表明，venetoclax和navitoclax对衰老肿瘤细胞显示出比初始肿瘤细胞更大的清除能力。

讨论

尽管TIS可以被视为癌症治疗中的一个有利结果，即癌细胞停止增殖，但新出现的证据表明，衰老是肿瘤细胞存活化疗（或放疗）并恢复增殖能力的一种机制。因此，开发消除衰老癌细胞的治疗策略有可能改善临床结果。Senolytics已经成为选择性靶向衰老细胞的潜在药物。在癌症背景下，navitoclax在 senescence-inducing agents（如顺铂、替莫唑胺、依托泊苷、吉西他滨和雄激素剥夺）后显示出显著的衰老清除活性。在乳腺癌中，navitoclax对多柔比星诱导的衰老肿瘤细胞具有强大的杀伤能力，无论是在体外还是在免疫缺陷小鼠模型的体内。相比之下，venetoclax先前并未显示出广泛的衰老清除潜力。然而，venetoclax作为单药和联合治疗（包括与多柔比星）在若干临床前和临床研究中显示出有希望的结果，而navitoclax（特别是用于实体瘤）的临床实施仍然面临许多挑战。鉴于venetoclax现已成为CLL和AML的标准护理，研究其在实体瘤模型中的潜在衰老清除活性似乎至关重要。

我们的研究结果表明，当乳腺肿瘤细胞被诱导进入衰老时，它们对navitoclax和潜在venetoclax的敏感性增强，这为剂量优化以减轻不必要的毒性（特别是血小板减少症）提供了机会。然而，必须承认，我们的发现不能明确确定观察到的navitoclax或venetoclax生长抑制增强 solely attributable to the culling of senescent cells。另一种同样合理的解释是，这两种BH3模拟物可能通过降低凋亡阈值来增强多柔比星的细胞毒性效应，而不依赖于衰老清除（senescence-selective）机制。多柔比星诱导复杂的细胞应激反应，包括DNA损伤、线粒体功能障碍和多种促生存通路（包括BCL-2家族蛋白）的激活。因此，我们观察到的敏感性增加可能反映了一种协同相互作用，其中BH3模拟物抵消了多柔比星暴露期间激活的代偿性抗凋亡防御，从而促进凋亡，即使在尚未完全进入稳定衰老状态的细胞中也是如此。

尽管venetoclax在体外清除多柔比星暴露的肿瘤细胞的能力不如navitoclax明显，但两种药物在荷瘤小鼠体内表现出相似的活性。venetoclax在多柔比星诱导的三阴性乳腺癌模型中的潜力最近也被另一个研究小组报道。该研究表明，venetoclax可以增强多柔比星诱导的细胞毒性，而不受测试的乳腺癌细胞系p53状态的影响，并伴有凋亡标志物（如cleaved-PARP和-caspase-3）的增加。虽然我们的研究支持该报告的结果，显示venetoclax在几种被多柔比星诱导衰老的乳腺癌细胞系中具有潜力，但Schreiber等人的研究似乎更可能反映了两种药物在某些测试细胞系中的相加效应，因为根据所使用的相对较高的浓度，venetoclax单独使用显著降低了细胞活力。类似地，一个肉瘤细胞模型显示，在高浓度下，venetoclax会降低衰老细胞（由辐射诱导）的活力；venetoclax对未辐射、非衰老对应物的影响再次表明联合效应主要是相加性的。最后，venetoclax的衰老清除潜力在体外与其他Bcl-2家族靶向药物（如Bcl-x_L特异性降解剂）联合使用时似乎更为明显。

关于凋亡，当观察到navitoclax对多柔比星的增敏作用时，在4T1和E0771细胞中，相对于多柔比星处理的细胞，凋亡同时增加。然而，venetoclax仅能在多柔比星暴露的E0771肿瘤细胞中显著诱导凋亡。值得注意的是，尽管多柔比星在E0771细胞中诱导了相对适度的衰老部分（约36% SA-β-gal阳性），但随后暴露于venetoclax或navitoclax仍然产生了相应比例的约20%的凋亡增加。衰老诱导程度与衰老清除触发的凋亡程度之间的这种密切对应关系支持了（尽管不是决定性的）这两种药物可能在该模型中以衰老选择性的方式诱导凋亡的解释。这些发现在体内实验中得到验证，在E0771荷瘤小鼠中，两种衰老清除剂在预先用多柔比星处理的组中显著诱导凋亡，与其他治疗组相比。这种效应可能归因于对上调的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x_L和Bcl-W的抑制。这种抑制释放了促凋亡蛋白如Bax和Bak，最终促进凋亡级联反应。值得注意的是，衰老乳腺肿瘤细胞对navitoclax的敏感性可能随着低Noxa表达而变化，使此类细胞对抗凋亡具有抗性，在这种情况下，衰老清除只能通过同时抑制Mcl-1来实现。在Schreiber等人的工作中，联合治疗导致线粒体外膜透化，引起细胞色素c释放并激活内在凋亡通路，这是解释BH3模拟物功能的经典事件。更重要的是，该研究报告venetoclax破坏了Bcl-2与促凋亡蛋白之间的相互作用，从而使细胞对多柔比星诱导的细胞死亡敏感。

在我们的研究中，venetoclax和navitoclax在多柔比星暴露后也显著降低了CDKN1A基因表达，相对于多柔比星或navitoclax单药治疗。这些数据表明，这两种药物可能部分通过抑制p21^Cip1活性来发挥作用。值得指出的是，两种细胞系都是TP53突变型。因此，我们的发现表明CDKN1A在衰老中的作用可能是p53非依赖性的。或者，衰老清除剂治疗后CDKN1A表达的降低也可归因于被凋亡杀死的衰老肿瘤细胞负荷的减少。这很可能解释了观察到的基因表达结果，以及衰老清除剂在消除CDKN1A介导的衰老中的作用。我们的数据还显示，在多柔比星诱导TIS后，navitoclax处理的细胞中IL6表达显著下降。这些结果表明navitoclax成功消除并减少了衰老癌细胞的负荷。相反，虽然4T1细胞对navitoclax敏感，但对venetoclax不敏感，但后者成功降低了CDKN1A和IL6 mRNA水平，这不太可能由细胞负荷减少引起。或者，venetoclax和相关的Bcl-2抑制剂已被报道发挥独立于衰老清除的抗炎和基因表达调节作用，这些作用通常很大程度上取决于具体背景。这些发现强调，CDKN1A和IL6可能不能作为跨实验模型可靠指示衰老清除活性的指标。

当前工作最关键的组成部分是发现venetoclax和navitoclax都能够在免疫健全小鼠模型中证明其衰老清除潜力。先前比较navitoclax和venetoclax衰老清除效应或证明venetoclax衰老清除潜力的大多数发现都来源于在免疫缺陷动物中进行的研究。例如，多柔比星与venetoclax的联合在免疫缺陷小鼠挑战MDA-MB-231人乳腺肿瘤细胞的模型中显示出更高的肿瘤生长抑制，与每种药物单独使用相比。有趣的是，venetoclax单独使用在该模型中对肿瘤生长影响很小甚至没有，这与其在体外浓度依赖性地杀死非多柔比星处理的（非衰老）乳腺癌细胞的能力不同。只有当venetoclax与多柔比星联合使用时，它才能在体内发挥协同效应，这伴随着衰老肿瘤细胞负荷的减少。值得注意的是，在这些研究中，多柔比星和venetoclax是同时给药的，而我们采用了在多柔比星之后序贯给予navitoclax或venetoclax的方法。在我们的工作中，两种药物都延迟了观察到的多柔比星治疗停止后肿瘤生长的恢复。文献中只有另外两份报告使用小鼠乳腺肿瘤细胞系提出了类似的观察结果，并证实了同样可靠的结果，证实了癌症治疗中“one-two punch”策略的前提。然而，这两份报告仅限于测试navitoclax的效果。我们的工作代表了首次尝试在免疫健全动物的乳腺癌模型中证明venetoclax体内衰老清除潜力的工作。我们还应注意，在这项工作中，没有提供关于多柔比星体内