《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Suppression of exosomal miR-199a-3p, a differentially expressed miRNA in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, promotes cell proliferation, osteogenesis, and angiogenesis while inhibiting dexamethasone-induced apoptosis
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本研究通过整合测序分析，揭示了miR-199a-3p在激素性股骨头坏死（SONFH）患者骨髓间充质干细胞（hBMSCs）及其外泌体（Exos）中显著高表达。功能实验证实，抑制miR-199a-3p可通过hBMSCs-Exos介导的通路促进成骨细胞（OBs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖、成骨分化和血管生成，并抑制地塞米松（Dex）诱导的细胞凋亡。该发现为SONFH的靶向治疗提供了新策略。
引言
激素性股骨头坏死（SONFH）是一种由长期或大剂量糖皮质激素暴露引起的进行性骨骼疾病，其特征是股骨头缺血及骨组织坏死。骨髓间充质干细胞（BMSCs）功能异常及其外泌体（Exos）介导的信号转导在SONFH发病中起关键作用，但具体分子机制尚不明确。外泌体是直径约30–150纳米的细胞外囊泡，携带蛋白质、脂质、核酸等生物活性分子，在细胞间通讯中扮演重要角色。本研究旨在通过高通量测序技术筛选SONFH相关外泌体通路中的差异表达基因，并重点探究miR-199a-3p在调控成骨和血管生成中的功能。
材料与方法
从SONFH患者和对照组（股骨颈骨折）的骨髓样本中分离并培养人骨髓间充质干细胞（hBMSCs），通过流式细胞术鉴定其表面标志物（CD73、CD90阳性，CD34、CD45阴性）。采用超速离心法从细胞培养上清中提取外泌体，并通过透射电镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和Western blot（检测CD63、TSG101蛋白）进行表征。利用二代测序（NGS）技术分析hBMSCs及其外泌体中的非编码RNA（ncRNA）、微RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA）表达谱，并通过实时定量PCR（qRT-PCR）验证miR-199a-3p的表达。通过转染miR-199a-3p模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）调控其在hBMSCs中的表达，并提取相应外泌体处理成骨细胞（OBs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs），在有无地塞米松（Dex）干预下，通过结晶紫染色、流式细胞术、TUNEL染色、碱性磷酸酶（ALP）染色/活性检测、阿尔新红（ARS）染色和血管形成实验评估细胞增殖、凋亡、成骨分化及血管生成能力。
结果
外泌体表征显示其呈典型杯状形态，粒径主要分布于100纳米左右，且高表达CD63和TSG101蛋白。NGS分析发现，SONFH患者hBMSCs及其外泌体中存在大量差异表达的ncRNA、miRNA和mRNA。整合分析共鉴定出659个差异表达ncRNA、11个差异表达miRNA（均上调）和1600个差异表达mRNA。GO和KEGG富集分析表明这些分子主要参与内吞作用、受体介导的内吞、细胞对 extracellular stimuli 的响应、骨矿化及p53信号通路等生物学过程。其中，miR-199a-3p在SONFH组hBMSCs和外泌体中均显著上调（log2FC=3.47）。功能实验表明，抑制miR-199a-3p可显著促进OBs和HUVECs的增殖、成骨分化（ALP活性升高、钙结节形成增加）和血管形成（管状结构长度及分支点增多），并抑制Dex诱导的细胞凋亡。相反，过表达miR-199a-3p则加重Dex对细胞的损害作用。
讨论
本研究首次通过整合测序揭示了SONFH中外泌体介导的通路中关键差异表达基因谱，并明确miR-199a-3p作为负调控因子，通过影响下游靶基因（如TGFBR、BMP、AKT、VEGF等家族成员）参与OBs和HUVECs的功能调控。抑制miR-199a-3p可缓解Dex导致的成骨障碍和血管损伤，提示其作为SONFH治疗靶点的潜力。然而，本研究尚未深入探讨miR-199a-3p的具体下游机制，且样本量有限，未来需在动物模型和临床样本中进一步验证。
结论
抑制miR-199a-3p可通过hBMSCs-Exos介导的通路促进细胞增殖、成骨和血管生成，并抑制细胞凋亡，从而对抗Dex的毒性作用。该发现为开发基于外泌体的SONFH靶向治疗策略提供了新思路。
