《Frontiers in Immunology》：Recombinant ROP8 antigen: diagnostics, immunogenicity, and therapeutic targeting in toxoplasmosis
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本研究系统评估了重组弓形虫ROP8（rROP8）蛋白的多维应用潜力。结果表明，rROP8在ELISA检测中展现出与天然抗原（TLA）相当的诊断效能（灵敏度与特异性均达100%），可作为优异的血清诊断工具。其通过激活NF-κB通路诱导单核/巨噬细胞产生TNF-α、IL-12p40等促炎因子，并驱动树突状细胞（DCs）成熟（CD80/CD83/CD86表达上调），进而极化CD4+T细胞向Th1/Th17表型分化（IFN-γ、IL-17A高表达）。此外，噻唑烷-4-酮衍生物通过药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）实验证实可与rROP8结合，抑制寄生泡（PV）形成，提示ROP8是潜在的治疗靶点。本研究为弓形虫病的精准诊断、疫苗研发及药物设计提供了新策略。
弓形虫ROP8抗原的多功能潜力评估
1 引言
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）作为一种专性细胞内寄生原虫，感染全球约30%人口，是导致人畜共患弓形虫病的主要病原体。其致病性严重依赖棒状体（rhoptry）分泌的效应蛋白，其中ROP8是ROP2蛋白家族的重要成员，分子量约为65.4 kDa，在速殖子（tachyzoite）和缓殖子（bradyzoite）阶段均有表达。ROP8虽缺乏丝氨酸/苏氨酸激酶活性，却是寄生泡（parasitophorous vacuole, PV）形成的关键因子，与虫体急性毒力密切相关。尽管现有诊断方法（如基于虫体裂解物TLA的ELISA）和动物用减毒活疫苗（如Toxovax?）已投入使用，但在人类精准诊断、安全有效疫苗及低毒性化疗药物研发领域仍存在显著空白。本研究旨在通过多学科手段，全面评估重组ROP8（rROP8）蛋白在弓形虫病诊断、免疫预防及靶向治疗中的潜在价值。
2 材料与方法
2.1 蛋白制备与验证
将编码ROP8（36–575 aa，登录号KM973070.1）的基因片段克隆至pET30 Ek/LIC载体，在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中诱导表达。通过镍亲和层析纯化获得电泳纯度超过90%的rROP8蛋白，计算分子量为70.58 kDa，等电点（pI）为7.04。使用内毒素去除柱确保细胞实验无LPS污染。
2.2 血清学评估
采用间接ELISA法，分别以rROP8（2.5 μg/mL）和天然抗原TLA（1 μg/mL）包被酶标板，检测实验感染BALB/c小鼠（感染后2、3、6、12周）及临床人血清（急性期50例，慢性期144例，健康对照138例）中的特异性IgG/IgM抗体。通过ROC曲线分析确定检测效能。
2.3 免疫原性分析
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单核/巨噬细胞活化：以rROP8（10 μg/mL）刺激人单核细胞系THP1-Blue（通过NF-κB诱导的SEAP报告基因检测激活）及小鼠巨噬细胞系ANA-1，检测上清中TNF-α、IL-12p40、IL-10浓度，并评估其对表达绿色荧光蛋白（GFP）的RH株速殖子（MOI=1:1）的吞噬清除能力。
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树突状细胞（DCs）与CD4+T细胞共培养：从健康献血者外周血单核细胞（PBMC）中分离单核细胞，经GM-CSF和IL-4诱导分化为未成熟DCs，再用rROP8刺激24小时。通过流式细胞术分析表面标志物（CD40、CD80、CD83、CD86）表达，Luminex多因子检测技术分析细胞因子谱（IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-23、IL-10、IL-4、IL-12p70、IL-17A）。随后将刺激后的DCs与自体CD4+T细胞以1:10比例共培养48及96小时，评估T细胞极化相关的细胞因子分泌与基因表达。
2.4 靶向治疗研究
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药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）实验：将rROP8与前期研究中筛选出的高活性噻唑烷-4-酮衍生物（82–88, 91–95，浓度5 μM）孵育1小时后，加入链霉蛋白酶（pronase，比例1:400）进行酶切。通过SDS-PAGE及ImageJ软件量化蛋白条带强度，评估化合物对rROP8的抗蛋白酶水解保护作用。
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寄生泡形成抑制实验：用化合物（IC50浓度）处理感染RH-GFP速殖子的人成纤维细胞（Hs27），24小时后通过共聚焦显微镜观察寄生泡数量及虫体分裂情况。
2.5 统计学分析
使用GraphPad Prism 10.2.2进行数据分析。组间比较采用t检验、单因素/双因素方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis检验，相关性分析采用Pearson或Spearman法。以p< 0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 rROP8的诊断效能
rROP8可有效检测小鼠感染后各时间点的IgG抗体（p< 0.0001），但对IgM的检测灵敏度在感染后期（12周）下降。在人类血清检测中，rROP8的ROC曲线下面积（AUC）表明其具有卓越的判别能力：在cut-off值为0.512时，灵敏度与特异性均达100%，与TLA抗原（灵敏度99.48%，特异性100%）相当。线性回归分析显示，rROP8与TLA的检测结果在慢性感染组（抗体滴度<100 IU/mL）相关性最佳（R2= 0.896），而在高滴度组（>200 IU/mL）斜率降低。
3.2 先天免疫细胞激活
rROP8显著激活THP1-Blue单核细胞的NF-κB通路（p< 0.0001），并诱导ANA-1巨噬细胞高分泌TNF-α（p= 0.008）和IL-12p40（p= 0.001），但不诱导IL-10产生，提示M1型极化。经rROP8预刺激的巨噬细胞对RH-GFP速殖子的清除能力增强，虫体存活率降低46%（p= 0.004）。
3.3 适应性免疫应答诱导
rROP8刺激的DCs表面共刺激分子CD40+CD83+（p= 0.0031）和CD40+CD86+（p= 0.0299）表达显著上调。细胞因子检测显示TNF-α、IL-23、IL-12p70产量升高（p< 0.05），同时伴随IL-10反馈性增加。在与CD4+T细胞共培养体系中，rROP8组在48小时和96小时均诱导了高水平的IFN-γ（p= 0.0035）和IL-17A（96小时，p= 0.0069）分泌，基因表达分析证实IFN-γ转录水平在48小时上调约70倍。IL-2和IL-4在早期短暂升高，而IL-10在96小时显著抑制（p= 0.0494）。结果表明rROP8驱动了强烈的Th1/Th17型免疫应答。
3.4 ROP8作为药物靶点的验证
DARTS实验显示，所有测试的噻唑烷-4-酮衍生物，尤其是(4-氧代噻唑烷-5-亚基)乙酸类化合物（91–95），均能显著保护rROP8免遭蛋白酶降解（p< 0.0001）。相对条带强度与化合物抑制弓形虫增殖的半数抑制浓度（IC50）呈显著负相关（Spearman r= -0.76, p= 0.0031）。共聚焦显微镜观察证实，经化合物处理的感染细胞中寄生泡数量减少，速殖子分裂受阻。
4 讨论
本研究首次对rROP8蛋白进行了从诊断、免疫预防到靶向治疗的综合性功能评估。在诊断方面，rROP8展现出替代传统TLA抗原的潜力，尤其适用于IgG抗体的高灵敏度、高特异性检测，为开发低成本、标准化的重组蛋白诊断试剂奠定了基础。在免疫预防方面，通过构建从先天免疫（单核/巨噬细胞NF-κB通路激活）到适应性免疫（DCs-CD4+T细胞轴）的完整in vitro评价体系，证实rROP8能诱导以IFN-γ为核心的Th1应答及辅助性的Th17应答，这两种反应在控制弓形虫感染中均发挥关键作用。此体系为未来疫苗候选抗原的高通量筛选提供了可靠模型。在治疗方面，本研究通过DARTS实验及表型验证，将噻唑烷-4-酮衍生物的高抗虫活性与其对ROP8蛋白的结合能力联系起来，为针对ROP8的靶向药物设计提供了直接实验依据。
5 局限性
本研究结论仍需进一步验证：诊断效能需在更大规模、多中心的临床样本中进行验证；rROP8的免疫保护效力最终需通过in vivo动物攻毒实验确认；DCs实验的 donor 数量可进一步增加以增强普适性；化合物抑制寄生泡形成的具体分子机制，尤其是ROP8功能被抑制的直接证据，有待深入探索。
综上所述，重组ROP8蛋白在弓形虫病的诊断、疫苗研发和新型化疗药物靶点探索中均展现出巨大的应用潜力，是多功能寄生虫抗原研究的典范。
