基于双相脉冲调制的高功率脉冲电化学发光技术实现果蝇幼虫行为光遗传学调控

《Light-Science & Applications》：High-power pulsed electrochemiluminescence for optogenetic manipulation of Drosophila larval behaviour

本文针对电化学发光器件(ECLD)因光输出不足和运行稳定性差而难以应用于光遗传学研究的难题，开发了一种结合激基复合物形成机制与双相脉冲调制的高功率脉冲操作策略。该策略实现了超过100 μW mm?2的极高亮度、长时程电化学发光，并成功应用于对表达CsChrimson的果蝇幼虫进行行为操控和实时成像，展现了ECLD在生物医学和神经光子学领域的应用潜力。

　　

在探索大脑奥秘的征程中，光遗传学技术如同一把精准的“光控开关”，让科学家能够通过特定波长的光来操控神经元的活动。然而，驱动这把“开关”的传统光源，如发光二极管(LED)和激光器，往往存在体积刚性、不透光或难以与生物组织紧密贴合等问题，这给实时观察光刺激下的生物行为带来了巨大挑战。特别是在研究像果蝇幼虫这样的小型模式生物时，如何在施加光遗传学刺激的同时，从最佳角度清晰成像其神经回路激活引发的精细行为变化，是一个亟待解决的难题。

电化学发光(Electrochemiluminescence, ECL)技术提供了一种潜在的解决方案。它通过电极表面的电化学反应产生光，其器件(ECLD)可以由液体、凝胶或墨水等流体材料构成，因而具备超薄、柔性甚至半透明的独特优势。想象一下，一个像透明贴片一样的光源，既可以发出控制神经元的光，又能让显微镜从下方直接穿透它观察样本，这无疑将为神经科学研究开启一扇新的大门。然而，理想很丰满，现实却很骨感。长期以来，ECLD的实际应用深受两大瓶颈的制约：一是产生的光强度远低于光遗传学刺激所需的最低阈值（通常需要10 μW mm^?2以上）；二是在高电压下工作时，有机材料和溶剂容易发生不可逆的副反应，导致器件稳定性急剧下降，无法满足长达数分钟的光刺激实验要求。以往的尝试，例如使用钌联吡啶Ru(bpy)₃²⁺的离子湮灭机制或加入共反应剂来增强发光，虽然在传感领域有所应用，但在构建高强度、长寿命的光源方面始终未能取得突破。

为了解决这些核心挑战，推动ECLD成为神经光子学研究的得力工具，研究人员在《Light: Science & Applications》上发表了他们的最新成果。本研究创新性地提出了一种高功率脉冲操作策略，通过将激基复合物形成机制与优化的双相脉冲电压波形相结合，成功实现了ECLD在光输出强度和操作稳定性上的巨大飞跃。研究人员不仅详细阐释了其高效发光的机理，更重要的是，他们将这项技术付诸实践，首次利用ECLD发出的光成功操控了果蝇幼虫的逃避行为，并同步通过半透明的器件实时记录了幼虫的行为反应，为ECLD在生物医学领域的应用树立了一个重要的里程碑。

本研究主要运用了几项关键技术方法：首先，设计了基于激基复合物形成与能量转移的ECL体系，使用高浓度的TAPC（给体）和TPBi（受体）分子以及TBRb（荧光染料）作为发光核心。其次，开发了双相脉冲电压驱动策略，通过任意波形发生器施加精确控制的短脉冲序列，并系统优化了脉冲电压、宽度、相位比例及间歇时间。第三，利用校准的光电二极管和光谱仪对ECL的光学功率密度(OPD)和器件寿命(LT₅₀)进行定量表征。第四，以转基因果蝇幼虫（基因型：412-GAL4; 20XUAS-IVS-CsChrimson-mVenus，饲喂含全反式视黄醇ATR的食物）为模型，将其置于ECLD像素点上，通过倒置显微镜并结合红外照明，在施加ECL光脉冲（通常为4秒开，6秒关）的同时，从器件下方实时拍摄并分析幼虫的体态角度变化和弯曲行为事件。

研究结果

重复氧化还原过程

研究人员首先构建了夹心结构的ECLD（玻璃/ITO/液体层/ITO/玻璃），并比较了三种不同溶液体系在快速三角波电压（±5 V, 20 Hz）下的电流响应。结果显示，含有激基复合物材料（TAPC和TPBi）及TBRb发光染料的器件，其电流响应比不含激基复合物材料（仅含TBRb）的器件和空白器件（仅含电解质）更为显著，且在进行45个循环的快速电压扫描后，其伏安曲线保持稳定，几乎没有电流衰减。这表明激基复合物途径能够支持快速、可逆的氧化还原反应，避免了传统离子湮灭机制中常见的因副反应导致的性能快速衰退，为后续施加高电压脉冲奠定了坚实的基础。

脉冲电化学发光

为了在避免离子积累的前提下实现高强度发光，研究团队采用了双相电压脉冲序列（例如，每相±5 V，持续1 ms，频率10 Hz）来驱动基于激基复合物的ECLD。他们观察到，在脉冲的第二相，ECL强度迅速上升，在0.33 ms时达到峰值（82.9 μW mm^?2），随后在约2 ms内缓慢衰减。通过模拟发现，第一相电压期间积累的TAPC阳离子与第二相生成的TPBi阴离子在电极附近反应形成激基复合物，进而通过能量转移使TBRb发光。研究表明，发光响应时间与器件的充电时间常数密切相关，缩短脉冲宽度（如从1.0 ms减至0.2 ms）可以加快响应速度，而提高脉冲电压（从4 V增至8 V）则能显著提升峰值光功率密度（从54.4 μW mm^?2增至192.0 μW mm^?2）。在器件寿命方面，在±10 V、0.2 ms脉冲宽度下，可获得101 μW mm^?2的平均OPD，其LT₅₀寿命为4304个脉冲（约7.2分钟）；而在要求较低的±4 V条件下，器件寿命可延长至42880个脉冲（约71.5分钟），平均OPD为10.0 μW mm^?2，这已满足果蝇幼虫光遗传学实验的基本需求。

波形调制

通过不对称地调整双相脉冲的宽度比（t₂/t₁）或电压比（V₂/V₁），研究人员探索了平衡正负法拉第电流（即离子浓度）对器件性能的影响。他们引入了一个“平衡因子”来量化这种平衡程度。结果发现，当第二相脉冲宽度适当增加（t₂/t₁= 1.25）时，离子浓度达到最佳平衡，器件操作寿命最长。然而，过度增加第二相电压虽然能提升瞬时发光强度，却因加剧副反应而缩短了寿命。因此，通过调制脉冲宽度来实现离子平衡是优化器件稳定性的更有效策略。

包含多个ECL脉冲的脉冲序列

为了实现持续数秒的高亮度光照，以适应光遗传学刺激的需要，研究人员将多个优化的双相脉冲组合成脉冲序列，并在脉冲之间引入了短暂的休息期。他们发现，当休息期≥0.45 ms时，可以有效“刷新”电极附近的离子分布，使得在连续施加多达800个脉冲（持续约0.7秒）的过程中，ECL强度保持稳定（平均OPD为46.2 μW mm^?2），几乎没有衰减。更长的休息期（如2.10 ms）则允许脉冲序列持续更长时间（如4.0秒），尽管平均OPD有所降低（15.6 μW mm^?2），但这为需要较长刺激时间的实验提供了可能。

果蝇幼虫的光遗传学刺激

作为本研究的最终应用验证，研究人员将表达光敏感离子通道CsChrimson（其激活光谱与ECLD的黄色发射光谱高度匹配）的果蝇幼虫放置在ECLD的发光像素点上。通过倒置显微镜和红外光从器件下方进行成像，他们在施加ECL光脉冲（4秒开，6秒关循环）的同时，实时观察幼虫的行为。结果表明，在喂食了ATR的实验组幼虫中，光照期间其身体角度（头部与尾部的夹角）显著减小（平均126°），相较于黑暗期（139°）表现出明显的身体弯曲行为，这是由激活的DnB中间神经元触发的逃避反应。实验组幼虫在光照期发生身体弯曲（角度<90°）的事件次数也显著多于黑暗期。更重要的是，其响应概率（即光照引发弯曲行为的几率）高达90%，远高于未喂食ATR的对照组（19%）以及被放置在非发光像素点（“脱靶”位置）的幼虫。这强有力地证明了ECLD发出的光能够有效、特异性地激活目标神经元，并引发可观测的行为变化，且排除了电、热或化学刺激等非光遗传学因素的干扰。

结论与意义

本研究通过巧妙地结合激基复合物化学与创新的脉冲驱动工程，彻底改变了ECLD的性能表现，使其从一种主要用于分析检测的工具，转变为能够满足苛刻生物医学应用要求的高性能光源。所实现的高功率密度（超过100 μW mm^?2）和显著改善的操作稳定性，突破了ECLD在光遗传学应用中长期存在的瓶颈。成功利用ECLD对果蝇幼虫进行光遗传行为操控，并同步实现透过器件的实时行为成像，充分展示了半透明ECLD所提供的独特实验灵活性——将刺激与观察合二为一。这不仅为研究小型模式生物的神经环路和行为提供了强大的新工具，也预示着ECLD在可植入式光遗传学设备、高通量神经药理学筛选以及需要非侵入式、集成化光刺激与成像的更多生物医学前沿领域拥有广阔的应用前景。未来的研究方向包括开发发射不同颜色光的ECLD，以匹配多种光敏感蛋白，从而进一步拓展其在神经科学和生物医学研究中的适用性。