《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Neutrophil-to-lymphocyte ratios as easy-to-use biomarkers for the diagnosis of active tuberculosis in children and adolescents
背景
结核病（TB）是全球传染病相关死亡的主要原因之一。根据《2024年全球结核病报告》，世界卫生组织（WHO）估计2023年有1080万新发结核病例和125万结核病相关死亡。值得注意的是，儿童和青少年占这些新病例的12%。然而，只有55%的病例被报告给公共卫生规划。病例检测的差距主要源于结核病诊断的挑战。儿童和青少年的结核病通常表现出非特异性症状，如发热、咳嗽和体重减轻。此外，该人群的疾病通常为菌阴性疾病，难以获得足够的痰样本。传统诊断工具在儿童中表现不佳，痰涂片抗酸杆菌阳性率低于15%。结核分枝杆菌（MTB）培养是“金标准”，但阳性率仅为30%-40%。在WHO 2022年发布的儿科结核病指南新版本中，建议使用Xpert MTB/RIF Ultra快速分子检测作为儿科结核病的初始检测。然而，尿液、粪便和其他非痰样本对Xpert Ultra诊断结核病的敏感性仍然不高。结核菌素皮肤试验（TST）和干扰素γ释放试验（IGRA）在免疫系统不成熟或受损的儿童中显示出敏感性降低。缺乏有效的诊断工具导致结核病治疗延迟。活动性结核病（ATB）诊断的延迟增加了严重并发症的风险，如粟粒性结核和结核性脑膜炎。同时也增加了儿科人群中结核病传播的机会。全球范围内，15岁以下个体中96%的结核病相关死亡发生在那些尚未开始治疗的人中。因此，迫切需要新的诊断工具。
近年来，中性粒细胞-淋巴细胞比值（NLR）作为一种低成本、易于计算的标志物，源自常规全血细胞计数（CBC），已成为结核病诊断中有前途的炎症生物标志物。多项研究已验证其在区分活动性结核病（ATB）与潜伏性结核感染（LTBI）或其他感染性疾病方面的效用。这些基于成人的研究结果为NLR在结核感染中的应用奠定了基础。然而，NLR的应用有几个局限性。首先，NLR缺乏特异性，因为它可以在细菌感染、恶性肿瘤和其他情况下升高。其次，NLR易受年龄、BMI和合并症等混杂因素的影响。第三，不同研究中NLR的诊断截断值各不相同。此外，儿童和青少年具有不成熟的免疫系统和生理性波动的NLR，因此不能直接外推成人结论。然而，目前关于NLR和结核病的儿科研究存在显著局限性。例如，Ma等人的研究仅包括176例结核病例，Kissling等人的研究仅包括12例结核病例。此外，这些研究没有调整混杂因素，如年龄和免疫状态。这些结果的局限性意味着它们不足以满足临床需求。另外，在临床数据集中，原始NLR值通常呈现偏态分布。这种偏态分布可能降低不同人群中诊断截断值的稳定性。NLR的对数转换（logNLR）可以增强炎症性疾病中生物标志物的一致性和可重复性。然而，logNLR在儿童和青少年ATB诊断中的应用仍未被探索。
为满足儿童和青少年ATB有效诊断的未满足需求，本研究探讨了logNLR的诊断价值。该研究招募了904名患有ATB的儿童和青少年以及176名非ATB组感染（包括细菌性肺炎、非结核分枝杆菌肺病和寄生虫感染）的对照组。我们收集了人口统计学、临床和实验室数据，其中包括中性粒细胞和淋巴细胞计数，然后应用受试者工作特征（ROC）曲线、逻辑回归分析、限制性立方样条（RCS）分析、分层分析和交互作用分析来评估logNLR与该人群ATB感染之间的关联。本研究首次旨在阐明logNLR对儿童青少年ATB的诊断性能。此外，我们确定了logNLR与ATB感染之间潜在的非线性关系和临界阈值。同时，我们进一步探讨了logNLR在不同亚组中的稳定性。本研究旨在证明logNLR作为儿童青少年ATB的一种简单、低成本的诊断生物标志物。
方法
我们进行了一项回顾性研究，对象为2022年4月至2024年12月期间在成都市公共卫生临床医疗中心住院的确诊为ATB的儿童和青少年。本研究获得了成都市公共卫生临床医疗中心伦理委员会的伦理批准（伦理批准号：YJ-K2024-75-01）。
研究的纳入标准是年龄在18岁以下的儿童和青少年，包括诊断为ATB和非ATB的患者。排除标准是临床或实验室数据不完整的患者（如缺少血常规、肝功能或肾功能检查结果）、确认感染人类免疫缺陷病毒（HIV）或诊断为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、合并其他可能影响研究结果的疾病（包括但不限于癌症和自身免疫性疾病）、非活动性结核病，或住院前有接受抗细胞因子治疗和/或其他免疫抑制治疗史的患者。
根据诊断将患者分为ATB组和非ATB组。ATB组进一步包括病原学确诊结核组（E-TB）和临床诊断结核组（C-TB）。具体来说，E-TB组包括同时满足MTB分子生物学检测阳性或MTB培养阳性结果，以及影像学表现符合结核病的患者；C-TB组包括影像学表现符合结核病（伴有或不伴有结核病临床症状）并对抗结核治疗显示阳性反应的患者。同时，非ATB组包括在同一研究期间住院并诊断为结核病以外疾病的患者，包括细菌性肺炎、非结核分枝杆菌（NTM）肺病和寄生虫感染。
我们从电子病历中获取人口统计学和临床数据，以进行ATB组和非ATB组病例之间的比较。
实验室分析
仅收集患者首次住院诊断期间的实验室数据。对于血常规数据，记录入院后24小时内获得的首次检测结果。对于其他实验室数据，收集入院后的初始检测结果。收集中性粒细胞、淋巴细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的绝对计数。对数中性粒细胞-淋巴细胞比值（logNLR）定义为中性粒细胞绝对计数与淋巴细胞绝对计数之比的对数。NLR、logNLR、单核细胞-淋巴细胞比值（MLR）、中性粒细胞-单核细胞-淋巴细胞比值（NMLR）和中性粒细胞-白蛋白比值（NAR）的计算方法见原文公式。
统计分析
我们使用电子病历系统进行数据管理。本研究采用全抽样方法，样本包括2022年4月至2024年12月期间在成都市公共卫生临床医疗中心住院且符合纳入和排除标准的患者。对于本研究中的数据，不服从正态分布的连续数据以M（Q1，Q3）表示，并使用秩和检验进行分析。分类数据用频率和百分比（%）描述，使用卡方检验比较组间差异。在检验组间差异时，我们选择χ2检验或Fisher精确检验用于分类变量，单因素ANOVA检验用于正态分布数据，Kruskal-Wallis H检验用于偏态分布数据。
我们观察到NLR数据存在偏态，因此在统计分析前对NLR值进行自然对数转换，使用对数转换后的NLR（logNLR）进行后续统计检验。为阐明logNLR与ATB感染之间的关系，我们建立了以最低四分位数（Q1）为参考组的逻辑回归分析。此外，在调整协变量后，我们进行了logNLR与ATB感染之间的限制性立方样条（RCS）分析，以研究潜在的非线性关系。我们进行了分层分析，以评估年龄、性别、民族、城乡居住地、卡介苗（BCG）接种、TST结果、MTB暴露史、CD4+T细胞和CD8+T细胞对logNLR与ATB感染之间关联的潜在影响。我们使用交互作用引起的相对超额危险度（RERI）、交互作用归因比（AP）和协同指数（SI）来评估相加交互作用。我们使用R软件和Free Statistics软件版本2.3进行统计分析。使用GraphPad Prism版本9.0绘制条形图。对研究对象进行描述性统计，显著性水平设定为P<0.05。
结果
研究参与者的基线特征
在2022年4月至2024年12月期间，研究共收集了1301名受试者。其中，根据排除标准排除了221例（17.0%），包括22例艾滋病或HIV感染，45例非活动性结核病（既往有抗结核治疗史、无结核病相关症状和体征、结核病病原学阴性、影像学病灶稳定的患者），24例使用类固醇治疗，44例患有其他疾病如肿瘤和自身免疫性疾病，以及86例数据不完整。最终，1080名患者的临床/实验室数据被纳入最终分析。患者分为非ATB组（n=176 [16.30%]）和ATB组（n=904 [83.70%]）。ATB组进一步分为E-TB组（n=594）和C-TB组（n=310）。
平均年龄为13.0 ± 3.7岁，其中115名（10.6%）参与者年龄在0-7岁，459名（42.5%）在8-14岁，506名（46.9%）在15-17岁。ATB组和非ATB组之间的年龄分布存在显著差异（P<0.001）。性别无显著差异（P = 0.328），565名（52.3%）参与者为男性。此外，城乡居住地（P = 0.006）、民族（P = 0.017）、MTB暴露状态（P = 0.012）、BCG接种（P<0.001）、TST结果（P<0.001）、CD4+T细胞计数（P<0.001）、CD8+T细胞计数（P<0.001）、NLR（P<0.001）、logNLR（P<0.001）、MLR（P<0.001）和NMLR（P<0.001）在ATB组和非ATB组之间观察到显著差异。相比之下，NAR（P = 0.333）在ATB组和非ATB组之间无统计学显著差异。在非ATB组、E-TB组和C-TB组之间的比较中，观察到类似的差异，包括年龄、城乡居住地和民族在内的13个变量存在显著总体差异（P<0.05），而性别无显著差异（P = 0.572）。详细信息见原文表1。
生物标志物的诊断性能
计算曲线下面积（AUC）以比较logNLR与其他生物标志物（MLR、NMLR和NAR）在预测ATB感染风险方面的准确性。图2展示了评估logNLR和其他生物标志物对ATB感染预测性能的ROC曲线。logNLR、MLR、NMLR和NAR的AUC分别为0.6214、0.6592、0.6260和0.5226。表2进一步提供了每个生物标志物的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、阈值和准确性。
logNLR与ATB感染的关联
表3展示了使用逻辑回归分析探讨的logNLR与ATB感染之间的关联。模型1（粗模型）显示logNLR与ATB感染呈正相关（OR = 1.84, 95% CI: 1.44-2.36, P<0.001）。在模型2（调整了年龄、性别、民族、城乡）中，logNLR仍然表现出显著的正相关（OR = 1.44, 95% CI: 1.11-1.87, P = 0.006）。在模型3（在模型2的基础上进一步调整了BCG、TST、暴露史、CD4和CD8）中，logNLR仍然保持显著正相关（OR = 1.38, 95% CI: 1.01-1.88, P = 0.044）。经过多变量调整后，logNLR每增加一个单位，结局事件发生的优势比分别增加44%（模型2）和38%（模型3）。
当logNLR被分为两组时，具有高水平logNLR的Q2组与参考组Q1相比，在模型1中显示ATB感染风险显著增加（OR = 2.06, 95% CI: 1.47-2.89, P<0.001）。类似地，在调整所有协变量后（模型3），与Q1相比，Q2仍然具有显著增加的风险（OR = 1.49, 95% CI: 1.00-2.89, P = 0.048）。与Q1相比，logNLR Q2组的参与者在调整后结局事件的优势比高出49%（模型3）。
logNLR与ATB感染的非线性关联
限制性立方样条（RCS）曲线的结果表明，logNLR与ATB感染风险之间存在显著的总体趋势（总趋势P<0.001）。在根据模型3（年龄、性别、民族、城乡、BCG、TST、暴露史、CD4、CD8）调整所有协变量的模型中，检测到两者可能存在非线性关系（P非线性=0.006）。logNLR的临界值约为0.9232。当logNLR<0.9232时，OR随着logNLR的升高而增加，表明logNLR是ATB感染的危险因素；当logNLR>0.9232时，OR趋于稳定或略有下降，表明其风险效应趋于稳定。
表4展示了logNLR与ATB感染关联的断点分析。该分析的估计断点为1.397。当logNLR<1.397时，logNLR与ATB感染之间存在强正相关（OR = 2.796, 95% CI: 1.96-3.99, P<0.001）。这种正相关表明logNLR的增加显著提高了儿童和青少年ATB感染的风险。相反，当logNLR>1.397时，logNLR与ATB感染之间的关联显著减弱（OR = 0.754, 95% CI: 0.291-1.951, P = 0.5598），并且这种减弱的关联没有统计学意义。此外，似然比检验结果（P = 0.016）证实了logNLR与ATB感染之间关系的显著非线性性质。
logNLR与ATB感染的分层分析
为评估这些人群中潜在的差异，我们基于模型3进行了分层分析，以研究logNLR与ATB感染在不同人群中的关系。在对交互作用检验调整所有混杂因素后，结果表明年龄、性别、暴露史、CD4、CD8亚组显著影响logNLR与ATB感染之间的关系（交互作用P<0.05）。结果揭示，在0-7岁和15-17岁年龄组、男性、有MTB暴露史、CD4+T细胞计数>414 cells/μL、CD8+T细胞计数>238 cells/μL的人群中，ATB感染风险与logNLR呈正相关（OR>1, P<0.05）。例如，15-17岁的参与者ATB感染风险显著更高（OR: 3.09, 95% CI: 1.74–5.48, 交互作用P<0.05）。
交互效应
我们对已识别因素之间关于ATB感染风险的交互作用进行了分析。对于CD4+T细胞计数（≤414 cells/μL）和MTB暴露史（是）之间的交互作用，单独CD4+T细胞计数≤414 cells/μL与ATB感染风险增加显著相关（OR = 3.05, 95% CI: 1.55-6.01, P<0.001），单独MTB暴露史与ATB风险升高边际显著相关（OR = 1.46, 95% CI: 1.00-2.12, P = 0.05）。同时具有CD4+T细胞计数≤414 cells/μL和MTB暴露史的患者与参考组相比，ATB风险显著更高（OR = 19.31, 95% CI: 2.66-140.15, P<0.001），并且这个组合的OR（19.31）在数值上超过了两个单独OR的总和（3.05 + 1.46 = 4.51）。类似地，同时具有CD4+T细胞计数≤414 cells/μL和0-14岁的患者与参考组相比，ATB风险显著更高（OR = 13.88, 95% CI: 4.34-44.40, P<0.001）。同时具有0-14岁和MTB暴露史的患者也与参考组相比显示出显著更高的ATB风险（OR = 6.71, 95% CI: 3.17-14.19, P<0.001）。
讨论
先天性和适应性免疫反应对MTB入侵的相互作用是连接NLR与ATB感染的潜在机制。中性粒细胞是最先浸润感染部位的先天性免疫细胞。当宿主受到外部病原体挑战时，中性粒细胞迅速发生趋化，在感染部位聚集，并有助于宿主防御微生物入侵。然而，过度的中性粒细胞活化可诱导组织损伤并触发促炎细胞因子（如IL-1β、TNF-α）的释放，从而破坏免疫稳态。淋巴细胞，特别是CD4+和CD8+T细胞，是针对MTB的适应性免疫所必需的。在ATB感染期间，它们的计数经常下降，这可能有利于MTB在宿主体内增殖。NLR更精确地描述了免疫细胞之间的动态平衡。NLR的升高表明中性粒细胞水平增加或淋巴细胞计数减少。对数转换（logNLR）使原始NLR值的偏态分布正态化。正如Zahorec在炎症生物标志物研究中所证明的那样，这种转换通过最小化与年龄和合并症等因素相关的变异性，增强了NLR作为生物标志物的可靠性。
我们的研究表明，MLR（AUC = 0.6592）比logNLR具有稍好的诊断价值，而NMLR（AUC = 0.6260）和logNLR（AUC = 0.6214）表现出相当的诊断性能。相比之下，NAR（AUC = 0.5226）没有显示出有效的判别价值。值得注意的是，MLR和logNLR的ROC曲线表现出高度相似的趋势，具有接近的敏感性和特异性表现。尽管MLR显示出稍好的诊断效能，但这种优势是微小的。我们的研究还证实，即使在调整了多个混杂因素后，logNLR对儿童和青少年的ATB仍具有重要的诊断价值。逻辑回归结果显示，在完全调整的模型（模型3）中，logNLR每增加1个单位与ATB风险增加38%相关。当logNLR分为两组时，高logNLR组（Q2）仍然比低logNLR组（Q1）有49%更高的ATB风险。这些发现与先前的儿科研究一致。
此外，我们的研究确定了logNLR与ATB感染风险之间的非线性关系，并确定了临界阈值。RCS分析显示logNLR与ATB之间的关系是非线性的（P非线性=0.006），临界值为0.9232。断点分析进一步确认了1.397的断点。据我们所知，这种非线性模式在以前的儿科ATB研究中未见报道，可能与儿童免疫系统的生理特性有关。在患有轻度至中度炎症的儿童和青少年中，升高的中性粒细胞计数或减少的淋巴细胞计数驱动logNLR大幅上升，表现出与ATB感染风险的强烈关联。风险初始的陡峭上升至logNLR=0.9232可能反映了响应MTB感染的先天性免疫的早期激活和中性粒细胞的募集。然而，当炎症严重时（logNLR>1.397），免疫系统可能进入“耗竭”状态。过度的中性粒细胞活化可能导致组织损伤，淋巴细胞计数可能被进一步抑制，导致logNLR与ATB感染不相关。这些阈值（0.9232和1.397）可以帮助临床医生进行风险分层：logNLR<0.9232的儿童可能ATB感染风险低，而0.9232≤logNLR≤1.397的儿童需要优先评估ATB。
此外，分层分析显示，logNLR作为ATB感染的诊断生物标志物在不同亚组中存在差异。结果表明，logNLR在0-7岁和15-17岁儿童、男性、有MTB暴露史者以及CD4+T细胞计数>414 cells/μL或CD8+T细胞计数>238 cells/μL者中是ATB的显著阳性预测因子（所有P<0.05）。其中，0-7岁儿童（OR: 1.91, 95% CI: 1.07-3.40）和15-17岁青少年（OR: 3.09, 95% CI: 1.74-5.48）显示出更强的关联，这可能归因于免疫反应。对于幼儿，适应性免疫系统中CD4+T细胞数量少，其整体免疫功能不成熟。在学龄初期儿童中，适应性免疫系统中的CD4+T细胞和CD8+T细胞数量稳定，免疫功能相对成熟和稳定。青少年处于免疫系统重塑阶段，CD4+T细胞的激活状态异常（例如HLA-DR+CD4+T细胞比例增加），青春期的激素变化破坏了免疫平衡。值得注意的是，logNLR在CD4+T细胞计数≤414 cells/μL或CD8+T细胞计数≤238 cells/μL的儿童中没有显著的预测作用（P>0.05）。这表明，在细胞免疫功能受损（例如由于营养不良或潜在免疫疾病）的儿童和青少年中，logNLR可能不是可靠的生物标志物——可能是因为严重的免疫抑制破坏了中性粒细胞和淋巴细胞之间的平衡，削弱了logNLR与ATB感染之间的相关性。因此，临床医生在评估免疫功能低下儿童的ATB时，应结合其他诊断工具（如Xpert MTB/RIF）。本研究还探讨了logNLR与其他因素（CD4+T细胞计数、MTB暴露史和年龄）之间的相加交互作用。同时具有CD4+T细胞计数≤414 cells/μL和MTB暴露的儿童ATB感染风险（OR = 19.31）远高于仅有任一因素者。受损的细胞免疫（低CD4+T细胞）降低了宿主防御，MTB暴露增加了病原体暴露。这两个因素的结合可能增强对ATB感染的易感性，从而影响logNLR作为ATB诊断标志物的作用。对于0-14岁者，不成熟的免疫力加上MTB暴露或低CD4+T细胞可能进一步削弱抗MTB能力，放大ATB感染风险。
本研究的数据来源于住院人群，未来的研究应扩展到门诊和初级保健机构，以验证logNLR在这些环境中的效用，这些环境的早期儿科ATB筛查至关重要。特别是在资源有限地区，迫切需要一种平衡速度、准确性和操作可行性的诊断工具，以解决儿科ATB诊断的瓶颈。源自常规全血细胞计数（CBC）的logNLR是一种不需要专业设备或技术知识的生物标志物，能够实现快速和低成本的初步评估。这与先进的诊断工具（如Xpert MTB/RIF Ultra或基于AI的成像）形成对比，后者由于依赖专业基础设施，在资源有限、高负担环境中仍然难以实施。因此，logNLR可以作为一种简单、具有成本效益的分诊工具。在初级保健机构中，logNLR可以作为一种分诊工具，优先对具有特定logNLR值范围的儿童进行进一步的确认检测，从而减少不必要的转诊并加速治疗开始。对于有轻微或非特异性症状的门诊患者，logNLR可能提供一种低成本的筛查选择，以排除高ATB风险。然而，这项研究有几个局限性。首先，它是一项单中心回顾性研究，可能引入选择偏倚（例如，所有参与者都是住院患者，排除了患有轻度ATB的门诊患者）。需要多中心前瞻性研究来在更多样化的人群中验证结果。其次，本研究中的非ATB对照组未包括病毒性呼吸道感染、炎症性非感染性疾病患者和健康对照。病毒性呼吸道感染在儿童和青少年中非常普遍，并且与ATB具有相似的临床表现，使其成为临床实践中关键的鉴别诊断。炎症性非感染性疾病的特征是全身性免疫激活，这会破坏中性粒细胞和淋巴细胞之间的平衡，并升高NLR。当使用logNLR诊断ATB时，这可能导致假阳性结果。此外，健康对照对于建立儿科人群中logNLR的基线范围至关重要，这使得能够确定升高的logNLR是否是ATB特异性的。第三，本研究未探讨抗结核治疗期间logNLR的动态变化。因此，尚不清楚logNLR是否可用于监测治疗反应。为解决这一局限性，前瞻性研究应追踪治疗期间logNLR的变化。
结论
总之，logNLR是一种简单、低成本且有效的生物标志物，用于诊断儿童和青少年的ATB，其效用尤其在男性、0-7岁和15-17岁、有MTB暴露史以及CD4+/CD8+T细胞计数正常者中显著。临界阈值（0.9232和1.397）为临床风险分层提供了精确的参考。尽管logNLR在免疫功能低下儿童中存在局限性，但作为辅助诊断工具仍具有重要的临床价值。未来的研究应侧重于在外部队列和多中心人群中验证logNLR，以及探索其与其他生物标志物（如NMLR、MLR）的组合以进一步提高诊断准确性。此外，还应研究logNLR在监测治疗反应中的效用。
