《Plant Biotechnology Journal》：A Specific Sinorhizobium Flagellin Suppresses Legume Nodulation Through Immune Activation
引言
植物区分有益和有害微生物的能力对其在自然界中的生存和发育至关重要。这种区分对豆科植物尤为关键，它们必须在维持对病原体强大防御的同时，平衡与固氮根瘤菌的有益共生关系。模式触发免疫（PTI）作为植物先天免疫的第一层，在介导这些植物-微生物相互作用中发挥着关键作用。PTI中最为熟知的分子模式之一是flg22，这是来自细菌鞭毛蛋白（FliC）的保守22氨基酸肽段。该激发子被富含亮氨酸重复受体样激酶FLAGELLIN SENSING2（FLS2）识别，从而触发强大的免疫反应以保护植物免受病原细菌感染。
然而，近期研究发现，尽管许多共生和致病细菌携带免疫原性flg22表位，但它们可能通过表位修饰（例如氨基酸替换、糖基化）来逃逸宿主免疫监视。例如，共生微生物群产生的flg22变体显示出进化修饰，似乎能够逃避宿主免疫检测。植物生长促进菌Pseudomonas simiae WCS417 actively抑制由flg22诱导的免疫通路基因表达。此外，病原菌Agrobacterium tumefaciens的flg22被Vitis riparia FLS2XL识别。这些发现表明，微生物在进化过程中发展出多样的免疫逃逸策略，而宿主则通过FLS2等位基因变异参与这一动态进化，为植物-微生物相互作用提供了新视角。然而，PTI在有益的根瘤菌-豆科植物共生中的具体且重要作用仍有待阐明。
豆科植物-根瘤菌共生是研究植物-微生物相互作用的优秀模型，不仅因为其在全球氮循环中的关键作用，还因为它为理解有益微生物定殖过程中植物免疫如何被调控提供了理想系统。成功的结瘤需要精确抑制植物免疫，这一过程由根瘤菌和宿主来源的因子共同协调。根瘤菌结瘤因子（NFs）是这种双重功能的例证，它们同时促进根瘤发育并抑制免疫反应。宿主植物也贡献了多种调控组分，包括蒺藜苜蓿中的Symbiosis receptor-like kinase (SymRK)、NODULES WITH ACTIVATED DEFENSE1 (NAD1)、DEFECTIVE IN NITROGEN FIXATION2 (DNF2)和Symbiosis cysteine-rich receptor-like kinase (SymCRK)，以及大豆中的抗性蛋白如Rj2、Nodule Number Locus1 (NNL1)和RPM1-interacting protein4 (RIN4)。这些研究突显了相容豆科植物-根瘤菌相互作用所需的复杂免疫调控。
在根瘤菌特性中，鞭毛蛋白的作用超越了其在细菌运动中的结构功能，影响着结瘤的成功。先前对大豆慢生根瘤菌USDA 110的研究表明，鞭毛蛋白依赖性运动能力显著影响根瘤菌在大豆中的侵染和结瘤。一个或两个fliC基因的突变降低了细菌游泳能力并减少了根瘤形成，表明运动性对慢生根瘤菌侵染的重要性。然而，豆科植物-根瘤菌共生似乎与经典的植物-病原体相互作用不同，其特点是在根瘤菌定殖过程中免疫反应极弱。鉴于鞭毛蛋白含有免疫原性flg22表位，有假说认为根瘤菌鞭毛蛋白经历了进化修饰以逃避宿主免疫识别。这一假说得到了观察结果的支持，即百脉根中慢生根瘤菌的flg22未能触发百脉根的免疫反应。然而，用免疫激发子flg22预处理会抑制百脉根的结瘤，表明植物免疫负调控结瘤。尽管如此，根瘤菌鞭毛蛋白在共生过程中植物免疫中的功能的直接证据仍然有限。
本研究旨在探讨中华根瘤菌鞭毛蛋白在植物免疫和共生结瘤中的功能。
结果
2.1 中华根瘤菌比慢生根瘤菌具有更保守的flg22序列
为了系统分析根瘤菌中鞭毛蛋白的多样性，研究人员从根瘤菌目中四个主要属（即慢生根瘤菌属、中慢生根瘤菌属、根瘤菌属和中华根瘤菌属，以及土壤杆菌属）下载了5811个基因组数据集，这些细菌能够在豆科植物上形成根瘤。总共识别出19,160个鞭毛蛋白。使用ε-变形菌纲的螺杆菌属和弯曲菌属作为外群，利用单拷贝直系同源基因构建了系统发育树。得到的系统发育显示，慢生根瘤菌属位于根瘤菌目最基部分支，随后是中慢生根瘤菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和中华根瘤菌属，这与最近的系统发育分析一致。鞭毛蛋白基因树显示，各属并非严格隔离，而是在多个分支中混合。慢生根瘤菌属和外群ε-变形菌纲在几个分支中紧密聚集，表明存在古老的同源保留或水平基因转移。
Flg22是鞭毛蛋白保守N端的22氨基酸肽段，是触发植物免疫的关键激发子。为了系统分析根瘤菌中flg22的多样性，研究人员搜索了一个大型数据集，从中识别出中华根瘤菌属2949个、慢生根瘤菌属3424个、中慢生根瘤菌属2102个、根瘤菌属8602个和土壤杆菌属2083个flg22序列。分析了每个属中flg22序列的变异。中华根瘤菌属（flg22Sin）和中慢生根瘤菌属（flg22Mes）、土壤杆菌属（flg22Agr）产生的flg22肽段比慢生根瘤菌属（flg22Bra）和中慢生根瘤菌属（flg22Mes）的更为保守。考虑到百脉根中慢生根瘤菌的flg22不会触发百脉根的免疫，研究人员将重点放在属内分歧较小的flg22Sin上。构建了flg22Sin和flg22Bra（作为对照）的分类树，表明flg22Sin的变异仅限于第1、7、10和11位残基，而flg22Bra的大多数残基都表现出变异。
2.2 来自中华根瘤菌的flg22肽段在大豆中引发ROS产生
为了研究flg22在豆科植物-根瘤菌共生中的生物学功能，研究人员选择了四种广泛使用的中华根瘤菌菌株进行深入分析：费氏中华根瘤菌HH103、费氏中华根瘤菌SMH12、苜蓿中华根瘤菌2011和费氏中华根瘤菌NGR234，它们的宿主分别是大豆、蒺藜苜蓿和百脉根。每个中华根瘤菌菌株的基因组中编码了四个fliC基因。基于系统发育分析和序列比对，16种不同的flg22肽段被分为三个进化枝：flg22Sin-I（Leu-7–Gly-10–Ser/Thr-11）、flg22Sin-II（Tyr-7–Glu-10–Thr-11）和flg22Sin-III（Leu-7–Gly-10–Glu-11）。
为了检测flg22Sin的生物学功能，化学合成了三个进化枝的flg22Sin肽段、flg22Bra和flg22Psg（源自大豆病原菌丁香假单胞菌大豆致病变种），并用于测量大豆植物的免疫反应。活性氧（ROS）爆发是表明植物免疫反应的典型特征。用flg22Psg和flg22Sin-II处理激活了大豆叶盘中的强烈ROS产生，而flg22Sin-III和flg22Sin-I则不能。flg22Sin-II触发的ROS水平略低于flg22Psg引发的水平。为了证实这一结果，研究人员从大肠杆菌细胞中纯化了重组全长FliC蛋白——来自费氏中华根瘤菌HH103的FliC7348（含有flg22Sin-II肽段）、来自丁香假单胞菌的FliCPsg（含有flg22Psg肽段）和来自大豆慢生根瘤菌USDA 110的FliC9604（含有flg22Bra肽段），然后进行亲和纯化，并在大豆叶盘中进行ROS测定。两种全长FliC蛋白，FliC-7348和FliCPsg，均能诱导大豆产生ROS。这些数据表明flg22Sin-II是大豆植物中的免疫激发子。
由于根瘤菌是侵染植物根部的微生物，研究人员随后检测了大豆根部的免疫反应。用flg22Psg或flg22Sin-II处理后，大豆根部诱导了MPK3和MPK6磷酸化，而flg22Sin-I或flg22Sin-III则没有。研究人员还检测了大豆根部几个免疫相关基因的表达。与对照相比，用flg22Psg或flg22Sin-II处理可诱导大豆根部GmRbohB1、GmWRKY33a、GmPR2和GmFLS2a的表达。这些发现共同表明，含有来自中华根瘤菌菌株的flg22Sin-II肽段的FliC蛋白保留了诱导豆科植物免疫反应的能力，但flg22Sin-II诱导的免疫水平略低于病原性flg22Psg诱导的水平。
研究人员将调查扩展到中华根瘤菌属，查询了837个公开可用基因组中编码flg22Sin-II基序的fliC等位基因。总共，837个菌株中有570个（68.1%）至少含有一个编码flg22Sin-II基序的fliC等位基因，表明该表位在中华根瘤菌属中广泛存在。其余267个菌株要么编码不同的flg22变体，要么缺乏典型的flg22Sin-II序列。这些数据支持了鞭毛蛋白触发的免疫可能是中华根瘤菌侵染过程中的一个常见特征的观点，这与flg22Sin-II可以在宿主豆科植物中激活FLS2依赖性免疫反应的实验证据一致。
2.3 含有flg22Sin-II的中华根瘤菌FliC负调控豆科植物结瘤
考虑到植物免疫反应已知会抑制豆科植物结瘤，研究人员检测了来自费氏中华根瘤菌HH103的FliC7348（含有flg22Sin-II肽段）在大豆结瘤中的作用。为此，研究人员构建了缺失fliC7348的费氏中华根瘤菌HH103突变株（HH103ΔfliC7348）和两个从其天然启动子表达fliC7348的回补菌株（HH103ΔfliC7348::7348-1和HH103ΔfliC7348::7348-16）。为了测试来自其他中华根瘤菌的含有flg22Sin-II的FliC蛋白是否也调控豆科植物结瘤，研究人员构建了额外的中华根瘤菌突变株：苜蓿中华根瘤菌2011ΔfliC8739（Sm2011ΔfliC8739，在编码鞭毛蛋白的基因WP_010968739中缺失）和费氏中华根瘤菌NGR234ΔfliC6870（NGR234ΔfliC6870，在编码鞭毛蛋白的基因WP_012706870中缺失），以及它们各自的回补菌株（Sm2011ΔfliC8739::8739-1, Sm2011ΔfliC8739::8739-5, NGR234ΔfliC6870::6870-1, 和 NGR234ΔfliC6870::6870-26）。
为了确定敲除中华根瘤菌中的fliC基因是否影响其运动性，研究人员评估了野生型、突变型和回补菌株的游泳能力。结果显示，野生型、突变型和回补菌株之间的游泳能力没有显著差异。因此，研究人员得出结论，单个fliC基因的敲除可能不影响中华根瘤菌的运动性。
接种费氏中华根瘤菌HH103ΔfliC7348的大豆植物（品种Williams 82, Wm82）产生的根瘤数量大约是接种野生型或两个回补菌株的两倍。这些数据表明，费氏中华根瘤菌HH103的FliC7348在大豆结瘤中起负向作用。研究人员随后用苜蓿中华根瘤菌2011和费氏中华根瘤菌NGR234菌株分别接种蒺藜苜蓿和百脉根的根部，并观察它们的结瘤表型。接种Sm2011ΔfliC8739的蒺藜苜蓿比接种野生型或回补菌株产生更多的根瘤。类似地，NGR234ΔfliC6870菌株在百脉根根部产生的根瘤也比接种野生型或回补菌株时多。这些结果证明，含有flg22Sin-II的FliC蛋白负向调控中华根瘤菌在豆科植物中的结瘤。
2.4 flg22Sin的Tyr-7是触发ROS产生的关键
三种flg22肽段flg22Sin-I、flg22Sin-II和flg22Sin-III表现出高度的序列保守性，但只有flg22Sin-II触发了植物免疫反应。这促使研究人员鉴定flg22Sin-II中负责触发植物免疫的关键残基。在flg22Sin第7、10和11位的三个残基中，先前的研究表明，基于晶体结构，flg22的第7位残基是与植物鞭毛蛋白受体FLS2相互作用的残基之一。因此，研究人员合成了变体flg22Sin-II-Y7L（Tyr-7被亮氨酸取代），并在ROS爆发试验中测试其活性。与完整flg22Sin-II肽段诱导的高ROS水平相反，flg22Sin-II-Y7L变体肽段未能诱导ROS产生。这些数据证明flg22Sin的Tyr-7残基是激活豆科植物免疫的关键残基。
flg22与FLS2-BAK1受体复合物的直接结合是一个众所周知的模型。研究人员随后使用AlphaFold3进行基于同源性的建模，以评估flg22Sin-II与大豆GmFLS2a胞外域的相互作用。经AlphaFold3评估，GmFLS2/BAK1/flg22Sin-II的ipTM/pTM值分别为0.66和0.59，而GmFLS2/BAK1/flg22Sin-II-Y7L的ipTM和pTM值分别为0.67和0.58。根据预测的对接结果，flg22Sin-II的三个残基，即Arg-2 (R2)、Val-3 (V3)和Tyr-7 (Y7)，分别与GmFLS2的Asp-101 (D101)、Asp-149 (D149)和Asp-221 (D221)直接接触。flg22的突变变体flg22Sin-II-Y7L显示不与GmFLS2a的D221结合。这些预测支持了ROS测定数据，即flg22Sin-II中的Tyr-7是激活大豆植物免疫反应的重要残基。
2.5 GmFLS2a和GmFLS2b均响应鞭毛蛋白
大豆基因组包含两个AtFLS2旁系同源物，GmFLS2a和GmFLS2b。为了研究GmFLS2a和GmFLS2b的功能，研究人员首先分析了它们在大豆不同组织中的转录水平。结果显示，GmFLS2a和GmFLS2b在根、茎、叶和根瘤中均有表达。GmFLS2b在根和根瘤中表达水平较高，而GmFLS2a转录水平较低。研究人员随后通过将GmFLS2a、GmFLS2b和拟南芥FLS2导入拟南芥atfls2突变体中进行回补实验来检测它们的功能。进行了flg22处理后的幼苗生长抑制试验。与atfls2幼苗生长未受影响的状况相比，用flg22Psg挑战的拟南芥野生型幼苗生长显著受损。表达AtFLS2、GmFLS2a或GmFLS2b的atfls2突变体幼苗在用flg22Psg处理后，与fls2突变体相比，生长均减弱。这些结果表明，GmFLS2a和GmFLS2b都能回补拟南芥atfls2突变体对病原性flg22处理的反应。
为了阐明GmFLS2a和GmFLS2b在大豆中的功能，研究人员利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术，通过敲除GmFLS2a和/或GmFLS2b，创建了单突变和双突变大豆植株。研究人员检测了所有得到的GmFLS2突变体（gmfls2a-1, gmfls2a-2, gmfls2b-1, gmfls2b-2, gmfls2a gmfls2b-1, 和 gmfls2a gmfls2b-2）对flg22Psg和flg22Sin-II的免疫反应。用flg22Psg处理在单突变体和野生型的叶盘中诱导了相似水平的ROS产生，但在gmfls2a gmfls2b双突变体的叶盘中则没有。有趣的是，经过多次测试，flg22Sin-II即使在双突变体中也引发了微弱的ROS产生，这表明大豆可能还有其他受体来识别根瘤菌flg22肽段。这些数据表明，GmFLS2a和GmFLS2b都参与了大豆中flg22触发的免疫反应。
2.6 GmFLS2介导的免疫抑制大豆结瘤
flg22Sin-II可以激活大豆的免疫反应，表明来自中华根瘤菌的FliC可能在豆科植物结瘤中起负向作用。为了验证FLS2在结瘤中的作用，研究人员检测了接种费氏中华根瘤菌HH103野生型和HH103ΔfliC7348突变株后，Wm82野生型和所有大豆突变体的结瘤表型。在接种后14天（dpi），所有大豆GmFLS2单突变和双突变体在接种HH103野生型后比野生型大豆产生更多的根瘤。在接种后28天，GmFLS2单突变和双突变体产生的根瘤数量与野生型大豆相似，没有观察到显著差异，表明flg22触发的免疫延迟了豆科植物根瘤的形成。然而，在接种后28天，GmFLS2单突变和双突变体根瘤中的固氮酶活性显著高于野生型根瘤。有趣的是，费氏中华瘤菌HH103ΔfliC7348（28 dpi）在接种到GmFLS2单突变和双突变体植株上时，与野生型相比，在生长速率、根瘤数量和固氮酶活性方面没有差异。所有这些数据表明，GmFLS2介导的免疫通过延迟根瘤形成和降低固氮酶活性来抑制豆科植物结瘤。
2.7 MtFLS2介导的免疫抑制蒺藜苜蓿结瘤
研究人员随后探究FLS2介导的免疫是否抑制其他豆科植物（如蒺藜苜蓿）的结瘤。基于序列同源物搜索，研究人员发现蒺藜苜蓿有一个与拟南芥AtFLS2密切同源的基因，MtFLS2。在接种苜蓿中华根瘤菌2011后14天，在根、茎、叶和根瘤中检测到MtFLS2转录本。根瘤中的MtFLS2水平低于叶和茎，但高于根。研究人员随后使用CRISPR介导的基因编辑在蒺藜苜蓿R108中创建了mtfls2突变体，以检测接种Sm2011和Sm2011ΔfliC8739后的结瘤表型。当接种Sm2011时，mtfls2突变体的根瘤数量和相对固氮酶活性高于R108。然而，当接种Sm2011ΔfliC8739时，mtfls2突变体和R108之间的根瘤数量或固氮酶活性没有差异。
考虑到细菌鞭毛蛋白在早期侵染过程中激活免疫，研究人员随后测量了mtfls2突变体中的早期共生表型。为此，用表达lacZ的Sm2011-lacZ或Sm2011ΔfliC8739-lacZ接种野生型（R108）和mtfls2突变体。在接种Sm2011-lacZ或Sm2011ΔfliC8739-lacZ后4天，在R108和两个mtfls2突变体中均可观察到根毛变形和侵染线。在野生型R108中，接种Sm2011ΔfliC8739-lacZ比接种Sm2011-lacZ诱导了更高数量的根毛变形、侵染线和根瘤隆起。在两个mtfls2突变体中，当接种Sm2011-lacZ时，观察到的根毛变形、侵染线和根瘤隆起数量高于野生型R108。此外，接种Sm2011ΔfliC8739-lacZ在R108中诱导的根毛变形数量低于mtfls2突变体，而R108和mtfls2突变体之间的侵染线和根瘤隆起数量没有观察到差异。
为了从分子层面深入了解这一点，研究人员随后分析了接种根瘤菌后4天蒺藜苜蓿中一些免疫和共生相关基因的表达。研究人员发现，与接种Sm2011相比，接种Sm2011ΔfliC8739后，R108中MtFLS2表达降低。相反，无论使用哪种根瘤菌菌株接种，mtfls2突变体中的MtFLS2表达保持不变。在R108中，接种Sm2011ΔfliC8739增强了由接种Sm2011诱导的MtCCaMK、MtNIN和MtNPL的表达水平。然而，与R108相比，接种Sm2011后，mtfls2突变体中这三个基因的表达并未降低。这些数据证实了MtFLS2介导的免疫抑制蒺藜苜蓿结瘤。
2.8 大豆gmfls2a gmfls2b双突变体根瘤中免疫相关基因的表达
上述结果表明FLS2在激活免疫和抑制结瘤中起重要作用。为了评估结瘤抑制是否是由于激活的免疫所致，研究人员进行了转录组测序（RNA-seq）分析，以测量早期（接种后14天）野生型和gmfls2a gmfls2b双突变体根瘤中免疫相关基因的表达。研究人员基于基因本体（GO）和KEGG通路富集分析进一步分析了来自野生型与gmfls2a gmfls2b突变体植株的差异表达基因（DEG）。GO分析中显著的DEG与细胞壁组织、几丁质响应和过氧化物酶活性相关。参与MAPK信号通路和Toll样受体信号通路的基因在KEGG通路分析中也高度富集。这些数据表明，在接种费氏中华根瘤菌HH103后，与免疫反应相关的转录重编程发生了显著变化。
在接种费氏中华根瘤菌HH103后14天，在Wm82根部发育的
