《Plant Biotechnology Journal》：A Fusarium sacchari Glycoside Hydrolase 12 Protein FsEG1 Is a Major Virulence Factor During Sugarcane Infection and Confers Resistance to Pokkah Boeng Disease via the HIGS Strategy
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本刊推荐：该研究首次揭示甘蔗斐济病菌（Fusarium sacchari）分泌的糖苷水解酶12家族蛋白FsEG1通过其水解活性降解植物细胞壁产生寡糖激发子（DAMPs），激活由膜定位受体NbWAKs/NbCERK1介导、依赖RAR1/MAP3Kα信号传导的DAMP触发免疫（DTI）新通路。研究创新性证明FsEG1既是关键毒力因子，又可作为宿主诱导基因沉默（HIGS）技术的有效靶点，为甘蔗抗 Pokkah Boeng 病（PBD）的分子育种提供了理论依据和实践方案。
摘要
甘蔗作为全球最重要的糖料和生物能源作物，其生产受到由斐济病菌（Fusarium sacchari）引起的Pokkah Boeng病（PBD）的严重威胁。本研究首次在F. sacchari中鉴定到糖苷水解酶12（GH12）家族分泌蛋白FsEG1，并系统解析了其在病原菌侵染过程中的双重功能机制。
1 引言
植物与病原菌的互作是推动双方协同进化的重要驱动力。在植物与病原菌互作的“主战场”——质外体空间中，病原菌分泌的细胞壁降解酶（CWDEs）是关键的致病武器。其中糖苷水解酶（GHs）是最大的一类CWDEs，近年研究发现其不仅参与病原菌的侵染过程，还可作为特殊的效应蛋白调控植物免疫。宿主诱导基因沉默（HIGS）技术通过植物体内产生靶向病原菌关键基因的小RNA，为作物抗病育种提供了新策略。
2 结果
2.1 FsEG1的鉴定与特征
FsEG1是F. sacchari基因组中唯一的GH12家族分泌蛋白，其编码基因包含两个外显子，编码250个氨基酸的蛋白，具有典型的GH12结构域和N端16个氨基酸的信号肽。系统进化分析显示FsEG1与尖孢镰刀菌FoEG1和禾谷镰刀菌FgEG1亲缘关系最近。酵母信号肽捕获系统证实其信号肽具有分泌活性，亚细胞定位显示FsEG1定位于细胞外空间和细胞核。
2.2 FsEG1是F. sacchari完全致病性所必需的
表达模式分析发现FsEG1在侵染过程中持续高表达，尤其在接种后24小时达到峰值。通过基因敲除和回补实验证实，ΔFsEG1突变体在甘蔗叶片上的致病力显著降低，病斑面积和真菌生物量明显减少，而菌丝生长和产孢能力未受影响，表明FsEG1特异性参与致病过程。
2.3 FsEG1诱导细胞死亡依赖其糖苷水解酶活性和质外体定位
瞬时表达实验显示FsEG1能够在本氏烟中诱发细胞死亡。序列比对发现FsEG1具有GH12家族保守的催化位点谷氨酸（E144和E231）。点突变实验证明酶活丧失的FsEG1SM突变体丧失细胞死亡诱导能力，而去除信号肽的FsEG1?SP也无法诱导细胞死亡，说明FsEG1的功能发挥需要完整的酶活性和正确的亚细胞定位。
2.4 FsEG1诱导的细胞死亡需要WAKs、CERK1、RAR1和MAP3Kα参与
FsEG1在本氏烟、番茄和辣椒中均能诱导细胞死亡，但在大豆、玉米和棉花中无此活性。病毒诱导基因沉默（VIGS）实验表明，FsEG1诱导的细胞死亡不依赖典型的PTI信号组分NbSERK3/NbBAK1和NbSOBIR1，也不依赖ETI关键蛋白NbSGT1。然而，沉默多个NbWAKs（WAK2/6/11/13/15）、NbCERK1、NbRAR1或NbMAP3Kα均能显著抑制FsEG1诱导的细胞死亡，提示FsEG1通过产生DAMPs激活植物免疫。
2.5 FsEG1触发多种免疫反应并增强植物抗病性
除细胞死亡外，FsEG1还能诱导本氏烟中H2O2积累、胼胝质沉积以及防御相关基因（NbHIN1、NbPR2等）的上调表达。预接种FsEG1显著增强植物对灰霉病菌（Botrytis cinerea）的抗性，而酶活丧失突变体无此效果。
2.6 转基因甘蔗展现显著抗病性
通过农杆菌介导的遗传转化，成功获得FsEG1过表达和HIGS转基因甘蔗株系。过表达株系中防御相关基因显著上调，对F. sacchari的抗性增强；HIGS株系中特异性siRNA（FsEG1-siRNA-2）有效沉默病原菌中FsEG1的表达，显著降低病害严重度。田间试验进一步验证了转基因植株的持久抗病性。
3 讨论
本研究揭示了GH12蛋白FsEG1在植物-病原菌互作中的新颖机制：一方面作为毒力因子促进病原菌侵染，另一方面通过酶活产生DAMPs激活植物免疫。与传统GH12蛋白作为PAMPs被识别的模式不同，FsEG1通过DAMP触发免疫（DTI）途径发挥作用，这一发现拓展了对糖苷水解酶家族蛋白功能多样性的认知。研究同时证明HIGS技术靶向FsEG1是防控甘蔗PBD的有效策略，为作物抗病育种提供了新思路。
4 材料与方法
详细介绍了植物和微生物材料培养、基因克隆、酵母信号肽验证、亚细胞定位、真菌遗传转化、蛋白纯化、活性检测、VIGS、转基因植株创制等一系列实验方法，为研究结果的可靠性提供了技术支撑。
