《Journal of Biological Chemistry》：Cell entry mechanisms of porcine enteric coronaviruses
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本文系统综述了猪肠道冠状病毒（TGEV、PEDV、SADS-CoV、PDCoV）利用其刺突糖蛋白（S）与多种受体、辅助受体及宿主因子结合，通过网格蛋白/小窝介导的内吞或直接膜融合等途径侵入细胞的分子机制，揭示了其广谱细胞嗜性及跨种传播潜力的结构基础，为开发靶向病毒侵入过程的广谱抗病毒策略提供了关键理论依据。
猪肠道冠状病毒的细胞侵入机制
引言
冠状病毒是一类具有囊膜的正链单股RNA病毒，属于巢病毒目冠状病毒科。目前已知的猪肠道冠状病毒主要包括三种α冠状病毒：猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV），以及一种δ冠状病毒：猪δ冠状病毒（PDCoV）。这些病毒主要引起仔猪的严重水样腹泻、呕吐、脱水和高死亡率，对全球养猪业造成巨大经济损失。它们能够感染猪、人等多种动物来源的细胞系，具有跨种传播的潜在风险。病毒侵入细胞是其成功感染的第一步，这一过程由病毒表面的S糖蛋白与宿主细胞表面的各种受体、辅助受体等因子结合并介导膜融合来完成。
猪肠道冠状病毒的侵入途径
作为专性细胞内寄生生物，病毒必须进入宿主细胞才能成功引起感染。病毒侵入是一个复杂的多步骤过程，始于与细胞表面受体的结合，终于将病毒基因组递送到细胞质中。为了克服细胞的物理屏障，病毒通常利用两种主要策略进入细胞：内吞途径和非内吞途径。内吞途径通常包括网格蛋白介导的内吞作用（CME）、小窝介导的内吞作用（CavME）和巨胞饮作用。非内吞途径涉及病毒膜与细胞表面质膜在pH非依赖性条件下的直接融合。
研究表明，TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV均能利用内吞途径（包括CME和CavME）进入细胞。例如，TGEV可通过CME和CavME进入猪睾丸（ST）细胞和肠道上皮细胞（IPEC-J2），该过程依赖于动力蛋白、胆固醇和低pH环境。利用单病毒追踪技术发现，PEDV能通过CME和CavME快速进入Vero细胞，整个过程平均仅需3分钟，并依赖于小GTP酶Rab5和Rab7进行胞内运输。SADS-CoV的侵入途径更为多样，除CME和CavME外，还能通过巨胞饮作用进入Vero和IPI-2I细胞，其胞内运输需要Rab5、Rab7和Rab9的参与。PDCoV的侵入途径则表现出明显的细胞类型依赖性，在ST细胞中主要利用CME和CavME，而在IPI-2I细胞中则依赖CME和巨胞饮作用，在LLC-PK1和PK15细胞中则主要利用CavME。此外，PEDV、SADS-CoV和PDCoV还能通过细胞表面的直接膜融合方式侵入细胞，这一过程通常由跨膜丝氨酸蛋白酶（如TMPRSS2/13或TMPRSS11E）对S蛋白的切割所激活。
受体、辅助受体和辅助因子
病毒成功进入靶细胞，首先需要与细胞表面的关键分子结合，这些分子通常被称为受体或辅助受体。
氨肽酶N（APN）
APN（也称为CD13）是一种广泛表达的锌金属蛋白酶。猪APN（pAPN）是TGEV和PDCoV的主要功能受体，与病毒的S1亚基结合，介导病毒内化。研究表明，pAPN也能介导PEDV的内化，但效率低于TGEV和PDCoV。值得注意的是，TGEV和PDCoV能够识别多种动物物种的APN直系同源物（如狗、猫、人等），这种广泛的受体使用与其跨种传播潜力密切相关。尤其有趣的是，尽管结构解析显示PDCoV的受体结合域（RBD）与人类APN（hAPN）的结合亲和力高于pAPN，但单病毒动力学分析发现，PDCoV通过低亲和力的pAPN内化更快，这可能反映了病毒在免疫逃逸和快速感染之间的一种进化平衡策略。
转铁蛋白受体1（TfR1）
TfR1（CD71）在铁缺乏的新生仔猪肠道上皮细胞表面高表达，可作为PEDV和TGEV的功能受体。TfR1通过其胞外区与PEDV的S1亚基结合，招募Src激酶并诱导网格蛋白包被的内吞囊泡形成，从而促进病毒侵入。这解释了为何铁缺乏的新生仔猪对PEDV等肠道冠状病毒更易感。
热休克蛋白（HSPs）
热休克蛋白家族A成员8（HSPA8/HSC70）通过与TGEV的M蛋白相互作用，促进病毒通过CME途径内化。而热休克蛋白家族A成员5（HSPA5/GRP78）则与PEDV的S蛋白结合，促进病毒的吸附和内化，并伴随病毒进入细胞，通过内体-溶酶体途径进行运输。
表皮生长因子受体（EGFR）
EGFR可作为TGEV的辅助受体，其胞外结构域1与TGEV的S1蛋白相互作用。EGFR与APN可协同促进TGEV进入猪肠上皮细胞，并激活PI3K-AKT和MEK/ERK信号通路。相比之下，PEDV感染则通过激活EGFR信号来抑制I型干扰素的抗病毒活性，从而促进病毒感染，但其在PEDV侵入过程中的作用尚不明确。
其他附着受体和凝集素受体
硫酸乙酰肝素（HS）作为附着受体，被PEDV、SADS-CoV和PDCoV利用。参与HS合成的关键酶D-葡萄糖醛酸C5-差向异构酶（GLCE）可促进PDCoV的吸附和内化。唾液酸是另一类重要的附着受体，TGEV可识别N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-乙醇酰神经氨酸（Neu5Gc），而PEDV主要识别Neu5Ac。参与唾液酸合成的宿主因子（如ST3GAL4、ST6GAL1、SLC35A1）对PEDV的吸附至关重要。C型凝集素DC-SIGN和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15（Siglec-15）也被发现可分别与PEDV的S蛋白、S1和M蛋白结合，促进病毒进入。
蛋白酶辅助因子
S蛋白的激活需要宿主蛋白酶在其S1/S2和S2‘位点进行切割。弗林蛋白酶（Furin）可切割SADS-CoV和PDCoV的S蛋白（尽管PDCoV的S蛋白不被Furin切割，Furin在其成熟释放中起作用）。胰蛋白酶（Trypsin）的添加对体外培养许多野毒株PEDV至关重要，它能切割PEDV S蛋白。跨膜丝氨酸蛋白酶（TMPRSS），如TMPRSS2/13可切割PEDV和SADS-CoV的S蛋白，诱导细胞表面融合；而TMPRSS11E则切割PDCoV的S蛋白。组织蛋白酶（Cathepsins）B和L在酸性内体/溶酶体中切割PEDV、SADS-CoV和PDCoV的S蛋白，激活膜融合。
其他宿主因子
双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（DYRK1A）通过增强pAPN的表达来促进TGEV的吸附和内化。死亡受体5（DR5）可促进PEDV的吸附。真核翻译起始因子4E（eIF4E）的磷酸化（p-eIF4E）通过上调膜驻留宿主因子（TSPAN3, CD63, ITGB2）的表达来促进PEDV附着。整合素αvβ3与pAPN协同促进PEDV内化，并通过激活FAK-PI3K-AKT信号通路促进PDCoV的早期侵入。内体分选复合物（ESCRT）相关蛋白，如肿瘤易感基因101（TSG101）和ALG-2相互作用蛋白X（ALIX），参与PEDV和SADS-CoV病毒颗粒向内体-溶酶体的运输过程。
结语
对猪肠道冠状病毒侵入机制的深入理解，不仅阐明了其组织嗜性、宿主范围和多物种感染潜力的分子基础，也为开发针对病毒吸附、内化、膜融合等关键步骤的新型广谱抗病毒策略（如中和抗体、受体阻断剂、蛋白酶抑制剂等）提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。未来的研究需要利用肠道类器官等更接近天然感染的模型，并借助高通量筛选和单粒子追踪等新技术，进一步揭示病毒侵入的动态细节和宿主因子的协同作用，为有效防控这些重要病原体奠定基础。
