《Journal of Biological Chemistry》：Structural Basis of DNA Aptamer A58 Targeting the N-terminal Domain of Sarbecoviruses Nucleocapsid Protein
编辑推荐：
本文针对后疫情时代冠状病毒持续威胁的挑战，聚焦SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）的N端结构域（N-NTD），通过解析DNA适配体A58与N-NTD的复合物晶体结构（分辨率2.8 ?），揭示其通过三重茎环结构与病毒RNA结合位点特异性互作，抑制RNA结合并阻断病毒免疫逃逸。该适配体对SARS-CoV-2变异株及多种SARS样冠状病毒（sarbecoviruses）均具高亲和力，为开发广谱抗病毒疗法提供新策略。
尽管全球已逐步进入后疫情时代，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的阴影仍未消散。更令人担忧的是，SARS样冠状病毒（sarbecoviruses）作为一类可能引发未来大流行的潜在“病原体X”，其威胁持续存在。病毒核衣壳蛋白（N蛋白）作为病毒颗粒组装的核心元件，不仅负责包裹病毒RNA，还能调控宿主免疫反应，因而成为极具潜力的抗病毒靶点。然而，由于N蛋白的核酸结合口袋较大，传统小分子抑制剂难以实现高效结合，开发新型靶向策略迫在眉睫。
在这一背景下，DNA适配体（aptamer）作为一种高亲和力、可精准设计的核酸分子，展现出独特优势。其中，A58适配体能特异性结合SARS-CoV-2 N蛋白的N端结构域（N-NTD），但其具体作用机制和广谱抗病毒潜力尚不明确。为揭示其分子机制，研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表研究，通过结构生物学与功能实验相结合，系统阐释了A58适配体的工作机制。
研究主要采用晶体结构解析（分辨率2.8 ?）、生物层干涉技术（BLI）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、免疫荧光显微术和流式细胞术等关键技术方法。实验中使用的N蛋白样本来源于SARS-CoV-2原型株及变异株（如Delta、Gamma），并通过大肠杆菌表达系统纯化获得。
2.1. A58 DNA适配体特异性结合SARS-CoV-2 N蛋白的NTD结构域
通过EMSA和BLI实验，研究发现A58能与N-NTD形成特异性复合物，亲和力高达23.13 nM，而随机序列DNA（N58）的亲和力低近千倍，表明A58通过序列特异性识别N-NTD。
2.2. A58-T10适配体与SARS-CoV-2 N-NTD复合物的整体结构
由于全长A58难以结晶，研究团队设计截短变体A58-T10，成功解析其与N-NTD的复合物结构。结构显示，两个A58-T10分子通过链交换形成对称同源二聚体，每个单体呈现H型霍利迪连接点（Holliday junction）结构，通过P1和P2茎环与N-NTD的带正电沟槽结合。
2.3. A58-T10适配体与N-NTD的结合特性
结构分析表明，A58-T10通过两个结合位点（Site 1和Site 2）与N-NTD互作。其中，Site 1内的dT14插入N-NTD的核酸结合口袋，与Tyr109形成堆叠作用，并与Ser51、Arg88、Tyr111、Arg149形成氢键，是结合的关键位点。点突变实验证实dT14的突变会导致结合能力丧失。
2.4. A58适配体包含两个特异性结合N-NTD的八核苷酸 motif
通过结构比对和突变分析，研究发现A58适配体含有两个八核苷酸 motif（5′-ACCGGATT-3′和5′-ATCGGATT-3′），能特异性识别N-NTD。截短构建体L1-8bp（22 nt）仍保持与N-NTD的高亲和力（KD=71.58 nM），而随机序列亲和力极低，说明 motif 的结构特异性是关键。
2.5. A58适配体及其变体阻断病毒RNA与N-NTD的非特异性结合
通过对比A58与双链RNA（dsRNA）、单链RNA（ssRNA）的结合模式，研究发现A58能竞争性抑制病毒转录调控序列（TRS）与N-NTD的结合，从而干扰病毒RNA包装。BLI实验显示，A58和L1-8bp均可有效抑制N-NTD与TRS的结合。
2.6. A58适配体通过阻断肝素与N-NTD的相互作用抑制其与细胞结合
N蛋白可通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate）结合，介导免疫调节。研究发现，A58能优先结合N-NTD，并抑制其与肝素的静电相互作用。细胞实验进一步证实，A58可减少N-NTD在HEK293T细胞表面的结合，而对照序列N58无此效果。
2.7. A58适配体对SARS样冠状病毒N蛋白具有广谱结合潜力
序列比对和结构分析表明，N-NTD在SARS-CoV-2变异株（如Delta、Gamma）及其他SARS样冠状病毒（如SARS-CoV、RaTG13）中高度保守。BLI实验验证A58与不同病毒N-NTD的亲和力均保持在纳摩尔级别，提示其广谱抗病毒潜力。
结论与展望
本研究首次揭示了DNA适配体A58通过特异性结合N-NTD的核酸结合口袋，抑制病毒RNA包装和细胞表面互作，且对多种SARS样冠状病毒均具高效抑制能力。这一发现不仅阐明了A58的分子机制，也为开发广谱抗冠状病毒药物提供了新思路。未来，通过理性优化适配体结构，有望进一步提升其稳定性和亲和力，推动其向临床应用转化。
