线粒体吞噬作用介导的铁死亡参与了2,5-己二酮在大鼠中引起的神经毒性

《Journal of Environmental Sciences》：Mitophagy-mediated ferroptosis involved in 2,5-hexanedione-induced neurotoxicity in rats

n-己烷代谢产物2,5-己二酮通过激活线粒体自噬引发神经元铁依赖性细胞死亡，铁螯合剂和ferrostatin-1可抑制该过程并缓解神经损伤。

　　

王文琼|马宇|李苏|王青山|侯丽燕

中国大连医科大学公共卫生学院，大连116044

摘要

n-己烷是一种广泛存在于环境和工业中的污染物，对健康构成严重威胁，尤其是具有神经毒性。长期暴露主要通过其代谢物2,5-己二酮（HD）引发感觉运动神经病变，但HD导致神经元损伤的机制仍不清楚。最新研究表明，铁死亡（一种依赖铁的程序性细胞死亡形式）参与了神经退行性过程。在本研究中，使用Sprague-Dawley（SD）大鼠暴露于HD以建立神经病变模型。通过使用铁螯合剂去铁胺（DFO）和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1来评估铁死亡的作用。通过监测线粒体自噬标志物并使用氯喹（CQ）抑制自噬来评估线粒体自噬在HD诱导的铁死亡中的潜在作用。在体外实验中，将PINK-1 siRNA转染到SH-SY5Y细胞中以探讨线粒体自噬对铁死亡的调节作用。HD暴露导致大鼠脊髓神经元中铁积累、脂质过氧化、线粒体异常以及GPX4水平下降。DFO或Ferrostatin-1治疗可改善这些变化并保持线粒体完整性。机制分析显示HD激活了线粒体自噬，表现为Beclin-1、LC3II、Drp-1和PINK-1上调，同时脊髓线粒体中的p62下调。CQ抑制了线粒体自噬，减少了铁沉积和脂质过氧化，并改善了运动功能。同样，在SH-SY5Y细胞中敲低PINK-1也减轻了HD诱导的线粒体自噬和铁死亡。这些发现表明HD通过激活线粒体自噬引发神经元铁死亡。抑制铁死亡或线粒体自噬可有效减轻HD引起的神经毒性，为减少环境n-己烷暴露对神经的损害提供了潜在的治疗策略。

引言

n-己烷是一种具有良好流动性的有机溶剂，广泛应用于橡胶制造、食品加工、药物配方和香水生产等多个工业领域（Huang等人，2020年）。随着室内装饰业的兴起，室内空气污染成为一个日益严重的问题。研究表明，挥发性有机化合物（VOCs）是主要的室内空气污染物，已鉴定出超过200种类型，其中n-己烷占相当大比例（Saini和Pires，2017年）。n-己烷可引起胃肠道损伤，进而引发表现为毒性神经病变的神经毒性效应（Huang，2008年）。长期暴露于这些化合物可能导致进行性周围神经病变，其特征是远端轴突退化、运动无力和肌肉萎缩。除了与阿尔茨海默病（AD）或帕金森病（PD）相关外，还可能诱发肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病（Jiao等人，2023年）。近年来，中国因n-己烷引起的职业中毒事件呈上升趋势。在一项控制暴露研究中，Tardif等人观察到健康志愿者在50 ppm（176 mg/m3）的n-己烷暴露下，尿液中的2,5-己二酮水平在3.6至4.25 mmol/L之间（约410.9–485.1 mg/L）（Tardif等人，2007年）。长期暴露于超过74 mg/m3的n-己烷浓度可导致毒性周围神经病变（Casagrande等人，2020年）。n-己烷在体内主要通过氧化反应代谢。初始氧化产物为2-己醇，可进一步转化为2-己酮或经过二次羟基化生成2,5-己二醇。这两种中间产物随后代谢为5-羟基-2-己酮和4,5-二羟基-2-己酮，最终氧化生成2,5-己二酮（HD），这是n-己烷的主要有毒代谢物（Perbellini等人，1980年）。n-己烷引起的神经病变发病隐匿且进展缓慢。初期症状通常较轻微，包括头晕、疲劳和食欲不振。随着持续暴露，患者可能出现手脚麻木、感觉障碍和肌肉不适。严重中毒可导致肢体无力、姿势不稳、肌肉萎缩，甚至下肢瘫痪，严重影响日常生活质量（Guan等人，2017年）。临床上，患者常接受鼠源神经生长因子治疗，但其效果有限，可能是因为病理机制尚不明确（Li等人，2020年）。因此，研究n-己烷引起的神经病变的病理机制对于提供研究基础和改善临床治疗效果至关重要。

铁死亡是一种最近发现的依赖铁的程序性细胞死亡类型，其特征是细胞内铁负荷过重和脂质过氧化加剧（Wang等人，2023年）。在活性氧（ROS）及其衍生物存在的情况下，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的脂质过氧化在铁含量增加的条件下被促进。这一过程会损害膜完整性，最终导致细胞死亡。与此机制一致的是，神经退行性疾病患者的特定脑区出现了异常铁积累，突显了铁失调与神经退行性病变之间的密切关联（Berry和Moustafa，2023年）。来自AD的证据表明，铁会干扰铁调节蛋白（IRPs）的正常功能。这种相互作用会干扰铁响应元素的调节，并与淀粉样前体蛋白（APP）mRNA的翻译增加有关（Zhou和Tan，2017年）。同样，在PD中，黑质（SN）中过量的铁沉积与丙二醛（MDA）和脂质过氧化物（LOOH）浓度升高有关（Jing等人，2021年；Koppula等人，2021年）。然而，铁死亡在HD引起的毒性神经病变中的作用仍不清楚。

铁死亡的调节涉及铁代谢、氧化还原平衡、线粒体功能以及多种疾病相关的信号通路。线粒体自噬是指选择性分解受损线粒体的过程，在维持线粒体完整性和整体细胞稳态中起着关键作用（Yan等人，2020年）。多项研究表明，线粒体自噬在多种神经退行性疾病模型中起作用，如AD、PD和年龄相关性黄斑变性（Li等人，2022年；Peng等人，2022年；Singh等人，2021年）。有报告指出HD可在培养的VSC4.1运动神经元细胞中诱导自噬性细胞死亡（Zhang等人，2018b）。在线粒体应激或病理条件下，线粒体呼吸链产生的过量超氧阴离子与亚铁离子反应生成不稳定的自由基和ROS，引发脂质过氧化，最终导致铁死亡（Choong等人，2021年）。在启动线粒体自噬过程中，PINK1-Parkin通路起着关键作用（Sarraf等人，2013年）。在PD中，PINK1或Parkin的突变会损害线粒体泛素化、自噬受体聚集和自噬囊泡成熟，从而破坏线粒体自噬并导致线粒体外膜蛋白积累（Gan等人，2022年）。此外，有证据表明，如TDCPP等化合物可通过PINK1–Parkin通路激活线粒体自噬，导致线粒体Fe2?水平升高、脂质过氧化物积累增加，并在PC12细胞中诱导铁死亡（Qian等人，2022年）。然而，线粒体自噬-铁死亡通路是否参与HD引起的毒性神经病变及其作用机制亟需进一步研究。

在本研究中，我们重点关注了线粒体自噬–铁死亡轴在HD引起的毒性神经病变中的作用。通过阐明这一机制，我们的发现可能有助于更好地理解n-己烷相关的健康影响，并帮助确定与其神经毒性相关的分子靶点。

试剂

HD、氯喹（CQ）、去铁胺（DFO）、Ferrostatin-1（Fer-1）和抗p-p47phox抗体购自Sigma（美国）。一组一抗，包括NF-L、MBP、GPX4、P62、FPN-1、TFR、铁蛋白、Beclin-1、PINK-1、GAP43、Keap-1、Nrf2和ACSL-4，主要从Abcam（美国）购买。GAP43抗体还从Proteintech（中国）获得，而针对P47的抗体由Thermo Fisher Scientific（美国）提供。用于检测MDA和GSSG/GSH的商业检测试剂盒

HD暴露会升高大鼠体内的铁含量

测量脊髓中的铁含量以评估HD暴露对铁分布的影响。与对照组动物相比，接受HD处理的大鼠脊髓铁含量升高，尤其是在200和400 mg/kg组中（图1a）。铁蛋白是一种主要的细胞内铁储存蛋白，对铁状态的变化有动态响应。分析铁蛋白表达发现，HD暴露大鼠的脊髓组织中铁蛋白表达显著下降

讨论

本研究阐明了线粒体自噬在HD诱导的大鼠神经毒性中的作用。主要发现包括：1）HD升高大鼠脊髓中的铁含量并诱导神经元铁死亡；2）铁螯合剂DFO和铁死亡抑制剂Fer-1可保护大鼠免受HD引起的神经毒性；3）HD激活大鼠的线粒体自噬；4）CQ处理可减弱HD诱导的线粒体自噬活化，从而减轻

结论

我们的研究表明，HD通过线粒体自噬–铁死亡通路引起神经元损伤，导致线粒体功能障碍、脂质ROS积累和铁依赖性神经元死亡。这些发现强调了加强环境监测和监管措施以限制n-己烷暴露的紧迫性，以及制定针对高风险人群的公共卫生策略以减轻其神经毒性影响的必要性。

作者贡献声明

王文琼：方法学、研究设计、数据管理。马宇：初稿撰写、项目管理。李苏：软件操作。王青山：撰写、审稿与编辑、资金获取、概念构思。侯丽燕：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82173557）、辽宁省教育部门2024年的基础研究项目以及大连医科大学健康与 wellness 跨学科研究合作项目团队的资助（项目编号JCHZ2023002）的支持。