《Advanced Science》：Logic-Gated HSV-TK/GCV Suicide Gene Circuit for Triple-Negative Breast Cancer
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本文报道了一种新型乳腺癌特异性自杀基因回路BRAS，该回路整合双启动子AND逻辑门与microRNA（miRNA）NOT逻辑门，通过利用肿瘤与正常细胞的分子特征差异，实现了单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）系统在乳腺癌细胞中的精准、特异性表达。研究显示BRAS回路能在患者来源的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中选择性诱导凋亡，并在两种原位乳腺癌模型中显著抑制肿瘤生长且无系统性毒性，为下一代癌症基因治疗提供了有前景的平台。
1 引言
三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，其特征是缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2表达，导致患者高复发率和不良预后。标准治疗方案包括手术联合新辅助和辅助化疗，但手术常难以实现肿瘤完全切除，而化疗对恶性细胞和正常细胞均产生非选择性细胞毒性，导致严重副作用和多药耐药性的产生。这些局限性凸显了对创新治疗方法的迫切需求。
自杀基因疗法代表了一种肿瘤选择性根除恶性细胞的策略。其原理是将自毁酶基因导入癌细胞，随后给予一种无害药物，该药物仅能在这些细胞中被转化为致命毒素，从而实现肿瘤自我杀伤而健康组织保持安全。单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）系统是研究最深入的自杀基因疗法之一。HSV-TK能将前体药物GCV磷酸化为毒性核苷酸类似物，诱导DNA链终止，从而杀死转导的肿瘤细胞。尽管在胶质母细胞瘤、肺癌和乳腺癌等多种癌症类型的临床前研究中取得了鼓舞人心的结果，但由于组成型启动子驱动的肿瘤特异性不足，HSV-TK/GCV的临床疗效仍然有限。
为提高肿瘤选择性，研究人员已采用多种天然和合成启动子来驱动HSV-TK表达，包括对缺氧、辐射和氧化应激等肿瘤相关条件响应的启动子。然而，尽管有这些创新，自杀基因疗法尚未取得令人满意的临床结果。
基因回路通过布尔运算（如AND、OR和NOT）模拟数字逻辑，使细胞能够处理复杂的输入信号并以精确的治疗行动作出响应。合成基因回路分析肿瘤特异性分子模式，并以比传统"始终开启"系统更高的准确性实施靶向干预。例如，可编程溶瘤病毒和microRNA响应回路已被设计用于动态响应肿瘤特异性信号并逃避免疫抑制。基于癌症特异性启动子活性或蛋白质水平的AND逻辑门已应用于多种癌症类型，而整合转录因子和microRNA输入的AAV兼容性HCC细胞分类器已证明HSV-TK的肿瘤特异性表达具有最小的脱靶效应。
在本研究中，研究人员开发了一种乳腺癌特异性自杀基因回路，称为BRAS（breast cancer-specific suicide），基于双启动子AND门和具有NOT门逻辑计算设计的故障安全层。他们筛选了在乳腺癌中高表达而在正常细胞中不表达的两个启动子（RRM2和MAFK），并引入microRNA-205（miR-205）作为额外调控层；miR-205在正常组织中丰富表达，但在TNBC细胞中水平极低。
2 结果
2.1 BRAS基因回路的设计与构建
为生成BRAS基因回路，研究人员构建了两个不同的遗传模块，每个模块由独立的启动子调控。在该回路中，输入启动子1（P1，PRRM2）驱动杂交转录激活因子（Coh2-p65-HSF1）的表达，其中转录激活因子p65-HSF1与来自热纤梭菌的Coh2结构域融合。输入启动子2（P2，PMAFK）驱动杂交DNA结合蛋白（Gal4 DBD-DocS）的表达，其中酵母Gal4 DNA结合域（Gal4 DBD）与来自同一细菌的Docs结构域融合。当两个启动子都活跃时，表达的Gal4 DBD结构域能够结合嵌合启动子（5×UAS-PhCMVmin），通过Coh2和DocS结构域之间的高亲和力相互作用触发治疗性输出基因的表达。
为鉴定在乳腺癌细胞中驱动基因表达的最佳特异性启动子，研究人员筛选了五个候选基因：核糖核苷酸还原酶亚基M2（RRM2）、细胞因子作用蛋白1（PRC1）、β-乳球蛋白（Mamm）、粘蛋白1（MUC1）和肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物K（MAFK），使用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因。研究发现RRM2和MAFK在TNBC细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-453和BT549）中表现出最强的启动子活性，而与正常乳腺上皮MCF10A细胞相比。
为减少正常细胞中的背景活性，研究人员设计了不同的BRAS启动子配置，并测试了PRRM2或PMAFK驱动Coh2-p65-HSF1和Gal4 DBD-DocS在TNBC细胞和MCF10A细胞中的组合。研究发现只有当两个模块在TNBC细胞中共激活时才能实现最高的荧光素酶输出，而当只有一个启动子活跃时表达可忽略不计。
为进一步简化系统，研究人员开发了包含两个遗传模块的单一质粒，最终获得了优化的串联构建体，其中PRRM2驱动Coh2-p65-HSF1，PMAFK驱动Gal4 DBD-DocS。为减少泄漏并提高系统靶向精度，研究人员引入了由microRNA（miRNA）调控的NOT逻辑门，这些miRNA在正常细胞中丰富但在TNBC中表达受抑制。基于癌症基因组图谱（TCGA）数据，研究人员选择了五个潜在候选miRNA，包括let-7c-5p、miR-30a-3p、miR-145-3p和miR-205-5p，这些miRNA在各种健康组织中高表达，但在乳腺癌细胞中不表达。
为验证miRNA作为故障安全层，研究人员将这些miRNA结合序列的单拷贝插入输出基因的3'-非翻译区（3'-UTR）。研究发现，引入miR-145-3p和miR-205-5p结合位点在乳腺癌细胞中产生比正常细胞更高的荧光素酶信号。值得注意的是，miR-205-5p在测定的五个候选miRNA中诱导最高的荧光素酶活性，而在MCF10A对照细胞中仅有基线活性。
研究人员进一步测试了不同拷贝数的miR-205-5p结合序列，发现单拷贝在TNBC和正常细胞之间产生最高的荧光素酶表达倍数变化。基于此，研究人员选择单拷贝miR-205-5p结合序列作为NOT门输入，以增强BRAS回路的安全性和选择性。
2.2 BRAS回路介导的HSV-TK/GCV的体外效应
研究人员接下来评估了BRAS回路使用HSV-TK作为治疗性输出与GCV联合的抗肿瘤功效。将包含单拷贝miR-205-5p结合位点的HSV-TK构建体与BRAS回路一起包装到慢病毒载体中，并转导至六个TNBC细胞系和正常乳腺上皮细胞。转导72小时后，使用CCK-8测定评估细胞活力。研究发现BRAS回路显著抑制TNBC细胞的活力，而在MCF10A细胞中观察到最小的细胞毒性。
值得注意的是，在用编码组成型表达HSV-TK/GCV-EGFP的慢病毒载体转导的TNBC细胞系和正常细胞中均观察到强EGFP表达和显著的细胞生长抑制。相比之下，仅在用BRAS构建体转导的TNBC细胞系中观察到强EGFP表达和细胞死亡，而在正常细胞中未检测到EGFP荧光信号和最小的细胞毒性。这些结果表明BRAS系统显著降低了脱靶毒性。
为评估细胞死亡，研究人员进行了乳酸脱氢酶（LDH）释放测定以评估膜完整性。研究发现，与MCF10A相比，用BRAS回路转导的这些TNBC细胞系中检测到升高的LDH活性，表明TNBC细胞系中细胞裂解增加。通过Annexin V/碘化丙啶（PI）染色评估细胞凋亡，流式细胞术数据显示，用BRAS回路转导的约40%-60%的TNBC细胞发生凋亡，而MCF10A中的凋亡仍然可忽略不计。
研究人员进一步在患者来源的原代乳腺癌细胞中验证了BRAS回路的治疗功效。研究发现BRAS回路在三阴性乳腺癌细胞中比在TNBC患者来源的正常上皮细胞中表现出显著更强的细胞毒性作用。此外，研究人员还评估了BRAS回路介导的HSV-TK/GCV的旁观者效应。CCK-8测定显示，在0%、20%、40%、60%、80%和100% BRAS转导的BT549细胞百分比中，BT549细胞活力分别为98.4%、51.4%、30.7%、23.5%、17.6%和13.4%，表明HSV-TK/GCV具有旁观者效应。相比之下，用BRAS转导的BT549细胞不影响MCF10A细胞增殖。这些结果表明其选择性治疗活性源于AND门和NOT门逻辑的第二调控层对HSV-TK的激活。
2.3 BRAS回路与HSV-TK输出在原位乳腺癌小鼠模型中的肿瘤特异性抑制
在确立BRAS回路的体外功效后，研究人员继续使用原位TNBC模型评估其治疗潜力。首先，通过将BT549细胞注射到免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪垫中建立原位乳腺癌小鼠模型。注射十天后，一旦肿瘤体积达到50-100 mm3，将小鼠随机分为四组，通过瘤内注射接受以下治疗：磷酸盐缓冲盐水（PBS，G1）、单独BRAS回路载体与HSV-TK输出（G2）、单独GCV（G3）、BRAS回路载体与HSV-TK输出加GCV（G4）。
只有G4（HSV-TK/GCV）组显示肿瘤生长显著抑制和肿瘤重量显著减少，而用PBS（G1）、单独HSV-TK（G2）或单独GCV（G3）处理的对照组显示肿瘤负荷随时间呈指数增加。G4组的平均肿瘤体积保持在50 mm3以下，而所有其他组的肿瘤超过300 mm3。重要的是，各组之间未观察到体重显著变化，表明治疗期间系统性毒性最小。
对所有组的肿瘤组织进行苏木精-伊红（H&E）染色、Ki67免疫组织化学和TUNEL测定分析。G4组的肿瘤显示Ki67表达减少和TUNEL阳性凋亡细胞增加，证实增殖减少和细胞凋亡增强。主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的组织病理学检查显示所有组均未检测到异常或组织损伤。此外，血液血清分析显示，肝酶包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）以及肾功能标志物（血尿素氮（BUN）和肌酐（CRE））保持在正常生理范围内。这些发现表明BRAS回路具有良好的系统性安全特征。
为研究BRAS回路与HSV-TK输出在体内的旁观者效应，通过将EMT6细胞注射到免疫活性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中建立原位乳腺癌小鼠模型。研究发现G4对肿瘤生长表现出比PBS、单独HSV-TK输出和单独GCV组更强的肿瘤抑制效应。收获肿瘤组织进行Ki67和TUNEL测定以及H&E染色。结果表明，与其他对照组相比，G4组小鼠肿瘤的增殖能力显著降低，凋亡显著增加。此外，与对照组相比，G4组肿瘤组织中CD4+和CD8+T细胞高表达。所有组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）均未观察到明显的组织学变化。这些发现证明BRAS回路介导的旁观者杀伤效应在GCV存在下有效抑制肿瘤生长，并在体内具有良好的生物安全特征。
3 讨论
在基因治疗不断发展的 landscape 中，合成生物计算通过将细胞类型特异性的负担从递送载体转移到遗传回路本身，提供了一种变革性策略。这种转变增强了设计灵活性，并将治疗范围扩大到以前认为难以接近或不可靶向的疾病。在本研究中，研究人员构建了BRAS基因回路，该回路通过整合双肿瘤特异性启动子AND门和NOT门作为额外故障安全层来执行逻辑计算。这种靶向设计实现了HSV-TK治疗性转基因的乳腺癌特异性表达，并通过六种TNBC细胞系、患者来源的肿瘤细胞和匹配的正常上皮对应物进行了实验验证。
尽管基因治疗在癌症治疗中具有巨大前景，但转化靶向必须满足以下要求：高肿瘤选择性和低脱靶毒性。传统的转录靶向策略通常依赖于在正常组织中也活跃的转录因子或启动子，增加了意外细胞毒性的风险。肿瘤特异性启动子在癌症中可变表达，为调控治疗性基因表达提供了更具选择性的机制。BRAS回路为TNBC中的精确靶向提供了合理有效的策略，其中只有当调控两个模块的两个启动子相互活跃时，靶输出才高水平表达，从而在不影响功效的情况下提高特异性。
基于HSV-TK的自杀基因疗法是一种成熟的方法，在多个实验和临床环境中已证明其潜力，但由于在非恶性组织中的泄漏表达，其临床转化受到脱靶毒性的阻碍。为解决这一问题，BRAS回路通过利用癌细胞中独特弱表达miRNA的第二调控层故障安全NOT门严格调控HSV-TK表达。研究表明，该回路在TNBC细胞中选择性诱导凋亡，对正常乳腺上皮细胞影响可忽略不计。此外，在两种原位小鼠模型中的体内应用在观察期间引发了强大的肿瘤抑制，且系统性毒性最小，突出了其在乳腺癌靶向自杀基因治疗中的转化潜力。
此外，整合双肿瘤特异性启动子和基于miRNA的NOT门的BRAS回路具有输出表达的双层控制（转录和转录后控制），与单一模式RNA-based回路相比降低了错误激活的风险。在先前报道的RNA-based逻辑回路中，当转录因子（TF）结合靶DNA时，游离TF浓度的时空动态变化导致由其调控的遗传设备行为显著改变。这不仅破坏正常细胞过程，资源共享也影响合成回路 supposedly 独立组分的表达，完全改变系统动态。
慢病毒由于其独特的生物学特征已被用作基因和细胞治疗的递送工具，包括大包装容量、高效整合到宿主细胞基因组、在一般人群中的固有低免疫原性以及诱导炎症和先天免疫应答的能力降低。在本研究中，BRAS回路的大小（约5.5 kb）允许将其包装在慢病毒载体中，确保体内高效递送。研究人员已证明负载BRAS回路的慢病毒载体可以高效转导小鼠肿瘤并表达靶基因。
然而，在优化BRAS回路用于临床应用方面仍存在若干挑战。提高体内递送效率至关重要，特别是对于全身给药。引入溶瘤病毒或工程非病毒平台，如脂质纳米颗粒和细胞外囊泡，可能改善肿瘤趋向性和有效载荷递送。此外，正常细胞中的回路泄漏可以通过实验来减轻，其中RRM2/MAFK启动子将通过人工智能特别是深度学习技术进行设计。该模型通过在数千个设计的启动子序列上进行转录速率测量和转录起始位点（TSS）作图来训练和测试，随后在细胞内表征的启动子上进行验证。此外，细胞异质性可能通过改变生物计算的逻辑结果导致肿瘤逃逸。为最小化治疗逃逸风险，可以引入旁观者杀伤输出和/或多模式效应器，整合细胞毒性和免疫调节功能。此外，临床前验证采用了两种乳腺癌细胞小鼠模型，在免疫活性系统（包括同系、人源化和患者来源的异种移植模型）中的进一步测试将有必要评估免疫应答并考虑肿瘤异质性。这些局限性必须在后续的临床前和临床研究中解决。
最后，合成回路的模块化为联合治疗开辟了途径。BRAS回路可以容易地适应编码免疫调节剂，如靶向免疫检查点（例如抗CTLA-4或抗PD-L1）的纳米抗体，从而实现同时肿瘤细胞杀伤和肿瘤微环境调节。该回路可用于表达CAR-T安全开关或铁死亡诱导剂用于癌症治疗。这种传感器-计算-执行器框架，当扩展以适应多样化输入和输出时，有望推动既精确又安全的下一代基因疗法的发展。
4 实验部分
（实验部分详细描述了研究中使用的方法和材料，包括伦理声明、BRAS基因回路的构建、质粒构建、细胞培养、细胞转染、慢病毒包装和转导、慢病毒滴度测定、RNA提取和cDNA合成、实时PCR、CCK-8测定、乳酸脱氢酶释放测定、Annexin V-FITC凋亡检测、BRAS系统性能评估、荧光素酶测定、原代人乳腺癌细胞的分离和培养、动物实验、体内BRAS回路在原位TNBC小鼠模型中的评估、H&E染色、肿瘤切片的TUNEL染色、免疫组织化学染色、肝肾功能分析以及统计分析。所有实验均按照相关指南和法规进行，确保了研究的科学性和伦理性。）
