《Advanced Science》：Decoding the Cellular Heterogeneity and Malignant Progression of Human Penile Squamous Cell Carcinoma by Single-Cell RNA Sequencing
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本文利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，首次系统描绘了阴茎鳞状细胞癌（PSCC）的肿瘤微环境（TME）细胞图谱，揭示了包括SEMA3Chigh恶性细胞、SPP1highTAMs、POSTN+周细胞等在内的关键细胞亚群及其相互作用网络，并鉴定出SEMA3C是驱动EMT（上皮-间质转化）、血管生成及预测淋巴结转移和预后的有效生物标志物，为PSCC的精准诊疗提供了新视角和潜在靶点。
1 引言
阴茎鳞状细胞癌（Penile Squamous Cell Carcinoma, PSCC）是一种罕见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，在发达国家其发病率约为每10万男性0.1-1例，但在一些低收入地区可占所有恶性肿瘤的10%。其风险因素包括不良卫生习惯、包皮环切术、包茎、HIV感染、吸烟及低社会经济地位等。目前PSCC的治疗手段有限，对于转移性或晚期癌患者通常难以治愈。值得注意的是，PSCC中多样的免疫细胞和免疫相关标志物已被证明是预测复发和生存的有效指标，这提示基于免疫的疗法是一种有前景的策略。然而，目前对PSCC肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）和关键致病途径的了解仍然有限。因此，理解PSCC中TME的复杂性对于早期诊断和治疗靶点开发至关重要。
TME包含多种肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞，它们在肿瘤的发生和进展中扮演关键角色。免疫细胞和基质细胞可能通过与肿瘤细胞的相互作用来影响抗肿瘤治疗的效果。单细胞RNA测序（scRNA-seq）为TME探索提供了前所未有的分辨率，增加了对PSCC异质性的认识。本研究旨在通过scRNA-seq在单细胞分辨率下表征PSCC的TME，剖析恶性、免疫和基质区室的细胞异质性，以揭示肿瘤进展和免疫抑制的潜在调控因子，特别关注识别可能作为生物标志物或治疗靶点的细胞状态和信号通路。
2 结果
2.1 解析人PSCC的细胞生态系统
为了阐明PSCC的细胞图谱，研究从10名患者的手术样本中获取了9个肿瘤样本和6个癌旁正常样本，并立即使用BD、Singleron和Seekone平台进行scRNA-seq。经过严格的质量控制后，从总共66,421个细胞中获得了单细胞转录组，并保留了53,224个基因用于下游分析。基因表达水平针对测序深度和线粒体读数计数进行了校正，并使用Harmony算法校正了批次效应。随后，利用Harmony校正后的主成分生成统一的UMAP嵌入空间，进行基于图的聚类，并使用经典细胞标记对每个簇进行注释。最终鉴定出9种主要细胞类型，包括成纤维细胞、上皮细胞、T细胞、周细胞/平滑肌细胞（SMCs）、内皮细胞、髓系细胞、B细胞、中性粒细胞和肥大细胞。研究发现，不同样本类型间的细胞类型比例差异很大，表明肿瘤和癌旁组织间的TME存在显著差异。随后，对上皮细胞、T细胞、髓系细胞、成纤维细胞、内皮细胞和周细胞/SMCs这些PSCC微环境的主要组成部分进行了更深入的分析。
2.2 PSCC微环境中上皮细胞亚群的异质性与特征
为了探索上皮细胞表达状态的变异，对8,999个上皮细胞进行了亚群划分，并根据inferCNV结果和已知代表性恶性肿瘤相关基因的表达将其鉴定为恶性细胞。CytoTRACE分析结果显示，SEMA3Chigh恶性细胞（Mals）在三个亚群中具有最高的干性评分。Monocle3分析表明，IGHG3+Mals倾向于分化为SEMA3ChighMals。Monocle3推断的伪时间与CytoTRACE分化评分之间存在强正相关性，表明两种方法捕获了相似的细胞进展轨迹。此外，SEMA3ChighMals在大多数“癌症标志”术语中得分较高，进一步支持其具有最高水平的恶性程度。差异表达分析表明，TGFBI、FN1、SEMA3C等EMT相关基因以及MMP相关基因在SEMA3ChighMals中上调。对EMT活性、PI3K通路活性和p53通路活性的评估显示，这些通路在SEMA3ChighMals中活性一致升高。根据淋巴结受累情况（N分期）对队列进行分层后，发现SEMA3C表达在淋巴结阳性（N+）病例中显著升高，且SEMA3ChighMals在淋巴结阳性患者中更富集。免疫荧光共染色实验显示，浸润区域（IV）的SEMA3C和VIM表达水平增加，而上皮特征相关蛋白（如E-cadherin）表达降低，暗示高表达SEMA3C的肿瘤细胞主要位于浸润灶内。体外实验利用人阴茎癌细胞系Penl1和Penl2培养肿瘤球，观察到SEMA3C、VIM、CD44和FN1在肿瘤球中表达，而E-Cadherin表达较弱。SEMA3C和CD44的免疫荧光染色提示SEMA3C可能也作为阴茎癌干细胞的标记基因。
2.3 T细胞与髓系细胞共同构成PSCC的免疫抑制微环境
TME内的免疫细胞在肿瘤发生中扮演双重角色。研究解析了T细胞和髓系细胞在PSCC中的功能。共检测到6个T细胞亚群：初始CD4+T细胞、调节性T细胞（Tregs）、耗竭CD4+T细胞、效应CD8+T细胞、耗竭CD8+T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）。功能富集分析显示，耗竭CD4+和CD8+T细胞的免疫效应功能显著受损。T细胞在不同组织中的分布差异显著，耗竭CD8+T细胞、效应CD8+T细胞和Tregs在肿瘤组织中富集，而初始CD4+T细胞浸润较低。耗竭CD4+T细胞、效应CD8+T细胞、耗竭CD8+T细胞和NK细胞在PSCC中均显示耗竭评分上调。耗竭相关基因在不同细胞类型中的表达存在显著差异。
对髓系细胞的亚群划分鉴定出6种亚型：SPP1highTREM2lowTAMs、SPP1lowTREM2highTAMs、SPP1lowTREM2lowTAMs、CD209+TAMs、单核细胞和树突状细胞（DCs）。TAMs作为髓系细胞的主要组成部分，其细胞簇比例在样本间差异显著。SPP1highTREM2lowTAMs和SPP1lowTREM2highTAMs在PSCC中富集，而SPP1lowTREM2lowTAMs和CD209+TAMs在癌旁正常组织中富集。M1/M2评分计算显示SPP1highTREM2lowTAMs表现出更多M2样特征，而CD209+TAMs显示更多M1样特征。对TAMs血管生成和吞噬作用评分的计算发现它们之间存在显著异质性。SPP1highTREM2lowTAMs的血管生成评分高于其他TAMs，而CD209+TAMs的吞噬能力最明显。这些结果及其在肿瘤中的高丰度表明SPP1highTREM2lowTAMs在PSCC中作为促肿瘤亚型发挥作用。通过全面的细胞间通讯分析，发现NECTIN2-TIGIT轴是SPP1lowTREM2highTAMs与耗竭T细胞之间特别强的配体-受体相互作用。多重免疫荧光染色揭示了NECTIN2+TAMs和TIGIT+CD4+T细胞在肿瘤组织中的紧密共定位，为配体受体表达细胞间的空间邻近提供了直接视觉证据。
2.4 CAF亚群与恶性细胞存在密切串扰
癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过分泌生长因子、炎症配体、ECM蛋白等促进肿瘤细胞增殖、治疗抵抗和免疫排斥。研究聚焦于成纤维细胞，探讨其在TME内的复杂性和动态关系。将13,445个成纤维细胞重新聚类为4种亚型：正常成纤维细胞（nFibs）、基质相关癌症相关成纤维细胞（mCAFs）、炎症性癌症相关成纤维细胞（iCAFs）和抗原呈递癌症相关成纤维细胞（apCAFs）。值得注意的是，mCAFs、iCAFs和apCAFs在肿瘤中富集。CytoTRACE和Monocle3结果均显示nFibs倾向于分化为mCAFs、iCAFs和apCAFs。Monocle3推断的伪时间值与CytoTRACE分化评分呈中度正相关。在肿瘤样本与癌旁正常样本比较中，mCAFs显著富集了粘着斑和ECM相关通路，iCAFs则富集了炎症相关通路。研究发现mCAFs中LEF1和CREB3L1上调，iCAFs中HMGA1和ETV4表达显著增加。细胞通讯分析显示，iCAFs和mCAFs与肿瘤细胞，特别是EMT-Mal（即SEMA3ChighMals）具有最强的相互作用，这种相互作用由多种信号通路介导，包括FN1和THY1信号通路。肿瘤细胞中的主要受体是整合素，能够识别这些配体。综上所述，iCAFs和mCAFs可能通过多种信号通路的细胞间通讯促进PSCC细胞的EMT。
2.5 POSTN+周细胞促进PSCC中的血管生成和ECM重塑
血管侵犯是PSCC进展的重要预测因子。研究系统分析了内皮细胞（ECs）和周细胞/SMCs，可将其分为多个亚组。比较不同样本的细胞丰度发现，POSTN+周细胞和尖端样毛细血管ECs是最突出的亚群。CytoTRACE结果显示POSTN+周细胞具有最强的干细胞样特征，暗示其在TME内处于非常活跃的状态。对POSTN+周细胞与其他两种周细胞亚群之间差异表达基因的功能富集分析显示，富集的通路包括血管发育和细胞外基质（ECM）组织。对周细胞介导的血管生成相关基因集的评估显示，POSTN+周细胞在三种亚型中表现出最高的血管生成特征评分。细胞间相互作用分析显示，在肿瘤样本中，POSTN+周细胞通过CSPG4信号通路与SEMA3ChighMals存在强相互作用，而与其他恶性细胞亚群未检测到相互作用。多重免疫荧光染色显示POSTN+周细胞在肿瘤组织中与CD31+内皮结构空间相邻。因此，POSTN+周细胞与肿瘤细胞之间的密切相互作用可能是驱动PSCC进展的关键因素。
2.6 SEMA3C是PSCC进展的有效生物标志物
为识别介导PSCC中TME重编程的关键相互作用，研究使用肿瘤和癌旁正常组织样本进行了细胞间通讯分析。根据相互作用丰度排名，最突出的信号通路被鉴定为特异存在于肿瘤或癌旁正常样本中。其中，SEMA3通路被发现连接SEMA3ChighMals与多种其他细胞，尤其是尖端样毛细血管ECs。随后在一个包含47名患者的临床队列中进行了免疫组织化学（IHC）染色以验证SEMA3C在PSCC中的表达。发现在大多数样本中，SEMA3C阳性染色倾向于位于浸润性肿瘤灶（IV区域）内，且IV区域的SEMA3C表达明显高于原位（IS）区域。免疫荧光共染色证明了CD34阳性（代表血管ECs）和SEMA3C阳性细胞在PSCC组织中的邻近性。此外，IV区域内的微血管密度（MVD）与SEMA3C表达呈显著正相关。SEMA3C表达与TNM分期相关，在III期和IV期样本中的表达显著高于I期和II期样本。在不同淋巴结转移程度的样本中，SEMA3C表达在N3和N4样本中高于N1和N2样本，且主要位于IV区域。这些结果表明SEMA3C与PSCC的进展和转移相关。功能实验表明，敲低SEMA3C会导致CD44、VIM和FN1表达水平降低，而E-Cadherin表达增加，肿瘤球形成能力和侵袭能力显著降低。过表达SEMA3C则促进细胞增殖、迁移和侵袭，伴随E-cadherin表达减少和β-Catenin核转位。生存分析显示，SEMA3C高表达患者的总生存期显著差于低表达患者。这些发现表明SEMA3C不仅是侵袭性肿瘤表型的相关因子，而且在功能上促进PSCC的增殖、侵袭和血管生成。
4 讨论
PSCC的术后复发和转移是影响预后的重要因素，解析TME的细胞异质性和特征有利于开发更有效的方法来阻止PSCC的进展。本研究通过对10名PSCC患者的66,421个细胞进行scRNA-seq分析，为TME的异质性提供了新的视角。研究揭示了参与PSCC发病机制的关键细胞亚群和细胞间相互作用，并确定SEMA3C作为有前景的临床应用治疗靶点。
总体而言，研究揭示了恶性细胞的异质亚群。SEMA3ChighMals在浸润灶中富集，并高表达SEMA3C和其他EMT相关基因。T细胞和巨噬细胞共同构成了PSCC的免疫抑制环境：耗竭T细胞在肿瘤组织中丰富，效应T细胞也高度耗竭，Tregs比例增加。SPP1highTREM2low和CD209+TAMs这两个异质性巨噬细胞群分别富集于PSCC和正常组织中。具有不同功能的CAFs被发现通过多种EMT相关信号通路与SEMA3ChighMals密切相互作用。
值得注意的是，一个名为POSTN+周细胞的特定周细胞亚群特异性地存在于PSCC中。研究发现POSTN+周细胞具有血管生成和ECM重塑的特征，并揭示它们与肿瘤细胞紧密相关，例如通过CSPG4通路与SEMA3ChighMals相互作用。POSTN+周细胞可能通过ECM重塑支持肿瘤生长和转移，并可能分泌CSPG4与SEMA3ChighMals通讯，进一步促进PSCC的血管生成。
最后，研究确定SEMA3C是PSCC中潜在的生物标志物和功能性驱动因子。一方面，SEMA3C在SEMA3ChighMals中特异性高表达并在浸润灶中富集，而在原发灶中几乎不表达。另一方面，对大规模独立临床队列的分析显示SEMA3C表达与肿瘤进展和转移程度相关，SEMA3C表达较高的PSCC样本中MVD水平较高。功能实验进一步支持了SEMA3C的促肿瘤作用。独立的队列数据表明SEMA3C表达可能具有预后意义。
因此，本研究建立了PSCC中SEMA3C介导的恶性转化模型。当PSCC以原发灶为主时，SEMA3C几乎不表达，MVD较低，肿瘤处于相对早期阶段。当SEMA3C在肿瘤细胞中高表达时，它可以促进肿瘤细胞与ECs的相互作用，并促进ECs从尖端细胞向茎干细胞转化，导致血管生成，最终促进肿瘤进展和转移。总之，我们的研究表明SEMA3C可能是PSCC有效的预后生物标志物和治疗靶点。
