《Advanced Science》：Discovery of SKP2-Recruiting PROTACs for Target Protein Degradation
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本研究发现SKP2（S-phase kinase-associated protein 2）可作为新型E3连接酶用于靶向蛋白降解（TPD）技术。通过优化获得选择性非共价SKP2招募剂SL1，并成功构建了BRD4降解剂2-1（DC50=298 nM）和AR降解剂3-4。研究证实降解机制依赖于泛素-蛋白酶体系统和neddylation修饰，且SKP2敲除可逆转降解效应，为扩大E3连接酶库提供了重要技术突破。
引言
传统小分子药物通过结合介导的拮抗或激动作用调节蛋白功能，但对缺乏活性结合口袋或具有多功能域的蛋白效果有限。靶向蛋白降解（TPD）技术利用分子胶（molecular glues）和蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）两类分子，其中PROTACs通过连接子将E3连接酶配体与靶蛋白配体结合，形成三元复合物促使靶蛋白泛素化和蛋白酶体降解。虽然人类基因组编码600多种E3连接酶，但目前仅少数（如VHL和CRBN）被成功应用于TPD，限制了该技术的发展。本研究首次探索SKP2（CRL1亚家族底物受体）作为新型E3连接酶在TPD中的应用价值。
SKP2招募剂的筛选与优化
通过文献调研筛选出不影响CRL1复合物形成的SKP2-CKS1抑制剂（22d、SKPin C1等），分子对接显示22d与SKP2结合最佳（对接得分-4.04），其吡啶环替换为苯环并引入羧基后得到SL1和SL3。CO-IP实验证实这些化合物可破坏SKP2-CKS1相互作用，CETSA和SPR进一步验证SL与SKP2结合亲和力（KD=1.81-3.95 μM）。最终选择SL1作为PROTACs构建的招募剂。
SKP2招募的BRD4靶向PROTACs的活性验证
通过连接SL1与BRD4抑制剂JQ1，合成13个PROTACs分子（2-1至2-13）。在MV-4-11细胞中，2-1表现出最强抗增殖活性（IC50=250 nM）和BRD4降解能力（10 μM时Dmax=99.6%）。剂量效应实验显示2-1的DC50为298 nM，优于其他类似物（如2-6的DC50=664 nM）。对比经典降解剂dBET1（CRBN基）和MZ1（VHL基）的DC50（约50 nM），SKP2基PROTACs活性稍弱，但与SKP2配体亲和力适中相关。
跨细胞系降解特性与机制研究
2-1在MOLM-13、MOLT-4和MDA-MB-231细胞中均诱导BRD4降解，但效率差异显著（MOLM-13细胞DC50=360 nM）。值得注意的是，2-1对BET家族蛋白降解具有选择性：在HEK293T和NCI-H2009细胞中有效降解BRD3、BRD4和BRDT，但对BRD2作用较弱。机制研究表明，2-1介导的降解依赖泛素-蛋白酶体途径，MG132（蛋白酶体抑制剂）和MLN4924（neddylation抑制剂）可阻断该过程。SKP2敲低或敲除实验证实降解作用严格依赖SKP2存在。
SKP2招募的AR降解剂开发与应用
通过连接SL1与AR拮抗剂AL，构建AR靶向PROTACs（3-1至3-10）。在22RV1细胞中，3-4展示最优AR降解效果（Dmax=95.1%，DC50=0.99 μM）和抗增殖活性（IC50=2.1 μM）。与BRD4降解机制类似，3-4的作用可被MG132和MLN4924抑制，且SKP2敲除细胞中降解效应显著减弱。
结论与展望
本研究首次将SKP2成功应用于TPD领域，填补了CRL1家族E3连接酶的空白。SKP2在肿瘤细胞中高表达的特性可能有助于减少治疗耐药性，但其配体SL1溶解性差（19.4 μM）和中等亲和力限制了当前PROTACs的疗效。未来需开发新型SKP2配体以优化降解活性和药代动力学性质，推动肿瘤选择性降解疗法的发展。
