天然负反馈环路调控水稻谷粒大小稳态的籼粳分化机制

《Advanced Science》：Natural Negative Feedback Loops Confer Indica-Japonica Differentiation for Grain Size Homeostasis in Rice

本文报道了水稻中由OsGRX8、OsbZIP47和OsbZIP08三个基因构成的天然负反馈环路，通过氧化还原依赖与非依赖双重机制精细调控谷粒大小稳态，揭示了籼粳亚种间形态分化的分子基础，为作物高产稳产育种提供了新靶点与理论框架。

　　

2.1 OsGRX8自然变异调控水稻籼粳亚种间谷粒长度多样性

通过全基因组关联分析(GWAS)在水稻533份核心种质中鉴定到染色体2上控制谷粒长度的显著位点，候选基因sGRX8(LOC_Os02g30850)编码CC型谷氧还蛋白。在4726份种质中鉴定出6个单倍型，主要单倍型H3(粳稻型)和H6(籼稻型)呈现显著的亚种分化与地理分布差异。启动子区变异vg0218413503(A/G)可能通过影响bZIP转录因子结合 motif(TGACG/TGACA)调控基因表达。功能验证表明过表达sGRX8导致谷粒变短，而CRISPR突变体谷粒显著伸长，证实其负向调控谷粒长度的功能。

2.2 OsbZIP47自然变异赋予水稻籼粳分化的谷粒长度差异

染色体6上GWAS信号定位到sbZIP47基因，其启动子区264-bp插入缺失变异与表达水平及谷粒性状显著相关。四种主要单倍型中H3(粳稻)和H4(籼稻)呈现相反的表型效应：H4单倍型与较长谷粒、较高表达水平相关。遗传互补实验证实sbZIP47过表达导致谷粒伸长，且与籼稻等位基因相比具有更强的功能效应。地理分布显示H3主要分布于欧洲，H4集中于东南亚和东亚。

2.3 OsbZIP08自然变异对籼粳分化及谷粒大小多样性的贡献

在染色体1号定位到bZIP转录因子基因sbZIP08，其启动子区A/T变异(vg0134314934)位于染色质开放区域，与表达水平和谷粒性状显著相关。单倍型H1(99%籼稻)和H4(93%粳稻)呈现明显的亚种分化与地理分布差异。功能研究表明sbZIP08负调控谷粒长度，CRISPR突变体谷粒显著伸长，而遗传互补实验验证其转录激活功能依赖于Cys³²⁷位点。

2.4 OsGRX8对OsbZIP47而非OsbZIP08进行氧化还原修饰

蛋白质结构预测显示OsbZIP47通过Cys¹⁷-Cys²⁶⁹分子内二硫键形成同源二聚体，而OsbZIP08无此结构。BIAM标记实验证实OsGRX8通过CCMC结构域(Cys⁴⁶/Cys⁴⁹)特异性还原OsbZIP47的二硫键，增强OsbZIP47-OsbZIP08互作。双分子荧光互补和酵母双杂交实验验证了三者间的相互作用网络，发现OsGRX8^C46S;C49S突变显著削弱与bZIP转录因子的互作能力。

2.5 OsbZIP47与OsbZIP08存在生化与遗传互作

实验证实OsbZIP47与OsbZIP08可形成异源二聚体，其中OsbZIP47^C269S突变破坏二聚化能力。双突变体sbzip47/osbzip08表型与sbzip08单突变体相似，表明sbZIP08位于sbZIP47遗传下游。单倍型组合分析显示不同基因型间存在显著的协同效应，解释10.7%-14.6%的产量性状变异。

2.6 通过OsGRX8-(OsbZIP47)-OsbZIP08模块实现sGRX8自身表达调控

EMSA实验发现OsbZIP08对籼稻型TGACG motif的结合能力强于粳稻型TGACA。染色质免疫共沉淀证实OsbZIP08直接结合sGRX8启动子，该结合可被OsbZIP47和OsGRX8抑制。双荧光素酶报告系统显示OsGRX8通过氧化还原依赖和非依赖两种途径抑制OsbZIP08的转录激活活性。H₂O₂/DTT处理实验证明氧化还原状态可调控sGRX8自身表达。

2.7 自我调控单倍型(SRHs)展现籼粳分化并对产量性状有重要贡献

三个基因的协同变异形成7种自我调控单倍型(SRHs)，其中SRH1(85.9%粳稻)和SRH4(73.4%籼稻)呈现显著亚种分化。选择清除分析表明这些基因在籼粳群体中受到不同的选择压力。SRH组合对产量性状的解释率显著高于单个基因，且与GS3、GW5等已知粒形基因存在上位性互作。

3 讨论

本研究首次揭示了作物中通过多基因协同形成的天然负反馈环路调控器官大小稳态的分子机制。OsGRX8-(OsbZIP47)-OsbZIP08-sGRX8和OsGRX8-OsbZIP08-sGRX8双重负反馈环路通过氧化还原依赖与非依赖机制，实现对谷粒大小稳态的精准调控。这种"赌注对冲"策略使水稻在不同环境条件下保持稳定的粒形发育。研究提出的SRH概念为解析复杂数量性状的遗传架构提供了新视角，为作物高产稳产育种提供了重要靶点。

4 方法

研究采用GWAS分析、单倍型网络分析、蛋白质互作验证、基因编辑、氧化还原状态检测等综合技术手段。首次应用AlphaFold3预测蛋白质三维结构，通过BIAM标记、ChIP-qPCR等实验验证了氧化还原修饰与转录调控的分子机制。利用4726份种质资源的自然变异信息，系统解析了基因功能与自然选择的关系。