钙通道阻滞剂通过Cav1.2-表观遗传环路抑制胰腺神经内分泌肿瘤进展

《Advanced Science》：Calcium Channel Blockers Inhibit Pancreatic Neuroendocrine Neoplasms Progression via Cav1.2-Epigenetic Circuit

本研究发现胰腺神经内分泌肿瘤(pNEN)中存在Cav1.2介导的钙信号与H3K27ac表观调控的正反馈环路，首次揭示钙通道阻滞剂(CCBs)特别是氨氯地平能有效抑制pNEN进展。研究通过多组学分析发现Cav1.2在pNEN中特异性高表达，并通过CaM-CAMKII-CREB1通路招募P300/CBP促进H3K27ac修饰，形成恶性循环。临床数据显示CCBs用药与更好的无进展生存期(PFS)相关，为pNEN治疗提供了新靶点和治疗策略。

　　

1 引言

胰腺神经内分泌肿瘤(pNEN)是起源于胰腺神经内分泌细胞的罕见异质性肿瘤，约占所有胰腺肿瘤的2%。近年来随着⁶⁸Ga-PET/CT等诊断技术的进步，pNEN发病率显著上升。根据WHO分类标准，pNEN可分为高分化神经内分泌瘤(pNET)和低分化神经内分泌癌(pNEC)，其生物学行为存在显著差异，治疗挑战主要源于肿瘤异质性。

表观遗传调控在肿瘤发生发展中起关键作用，H3K27ac作为活跃增强子和超级增强子的标志，参与基因激活和肿瘤细胞功能调控。钙信号通路是高度保守的细胞信号传导途径，钙通道阻滞剂(CCBs)是广泛应用于心血管疾病的药物。本研究通过临床分子分析，首次揭示了Cav1.2介导的钙信号与H3K27ac表观调控之间的正反馈环路，并探讨了CCBs抑制pNEN进展的机制和临床价值。

2 结果

2.1 异常H3K27乙酰化通过P300/CBP介导与不良预后相关并调控pNEN中钙信号通路

多组学分析显示，pNEN组织中启动子区域的全局H3K27ac信号显著增强。组蛋白乙酰化酶EP300(P300)和CREBBP(CBP)在pNEN中显著上调，组织微阵列免疫组化验证了其在肿瘤组织中的高表达。临床数据分析表明，P300/CBP高表达与更大的肿瘤直径和更差的无进展生存期(PFS)相关。

整合H3K27ac ChIP-seq和RNA-seq数据发现，771个重叠基因显著富集于钙信号通路。使用P300/CBP抑制剂A485和C646处理后，pNEN细胞系BON-1和QGP-1中H3K27ac水平降低，细胞内钙浓度显著下降，钙成像实验进一步证实了该现象。这些结果说明异常H3K27ac通过P300/CBP激活pNEN中的钙信号通路。

2.2 pNEN特异性表达的Cav1.2在Ca²⁺刺激下聚集

单细胞转录组分析鉴定了14种细胞亚型，其中SSTR2表达亚型被确定为肿瘤细胞。钙信号通路基因特异性表达分析显示，CACNA1C(Cav1.2通道最重要亚基)在pNEN细胞中特异性高表达，而在正常内分泌胰腺和非肿瘤细胞中不表达。免疫荧光证实Cav1.2与SSTR2共定位在细胞膜上。

TIRF显微镜单分子追踪显示，外源性钙刺激下Cav1.2形成更多簇状聚集点，荧光强度增强，平均簇尺寸增大，邻近簇分析表明钙刺激促进Cav1.2聚集，从而激活细胞内钙信号。

2.3 Cav1.2促进pNEN进展

基因敲低和过表达实验证实，CACNA1C敲低显著抑制pNEN细胞增殖和克隆形成能力，而过表达促进细胞生长。钙响应性实验显示，CACNA1C敲低细胞对外源性钙刺激无反应。体内实验进一步验证，BON-1细胞来源的异种移植瘤(CDX)模型中，CACNA1C敲低组肿瘤体积和重量显著减小，Ki-67表达降低。

2.4 Cav1.2与pNEN恶性生物学行为相关

ICGC数据库分析显示，肿瘤细胞特异性CACNA1C高表达与更差的PFS、更高的疾病进展比例和远端转移率相关。临床队列研究证实，Cav1.2高表达患者具有更高的Ki-67指数、更高比例的G2/G3分级、更大的肿瘤直径以及更高的肝转移和淋巴转移率。这些结果表明Cav1.2是pNEN恶性生物学行为的重要指标。

2.5 Cav1.2通过CaM-CAMKII-CREB1通路招募P300/CBP诱导局部H3K27乙酰化

ChIP-qPCR显示CACNA1C基因位点存在H3K27ac、CBP和P300的富集。转录组测序发现，CACNA1C敲低导致2284个差异表达基因，GSEA分析显示H3K27ac转录激活基因集负向富集。Western blot显示CACNA1C敲低后全局H3K27ac水平降低，而P300/CBP蛋白水平稳定。

机制研究表明，Cav1.2通过CaM-CAMKII-CREB1通路促进CREB1磷酸化，增强P300/CBP结合能力。使用Cav1.2激动剂FPL64176可上调该通路关键分子表达，而CAMKII抑制剂KN-93和CREB1抑制剂666-15能逆转这一效应。这些结果证实Cav1.2通过CaM-CAMKII-CREB1通路招募P300/CBP，在CACNA1C基因位点形成局部H3K27ac修饰的正反馈环路。

2.6 钙通道阻滞剂抑制pNEN进展

在六种CCBs中，氨氯地平对pNEN细胞生长的抑制效果最佳，其IC₅₀显著低于奥曲肽、依维莫司和替莫唑胺。氨氯地平处理显著抑制pNEN细胞克隆形成和EdU阳性细胞比例，诱导时间依赖性细胞死亡。CDX模型显示，氨氯地平治疗组肿瘤体积和重量显著减小，Ki-67表达降低。

分子机制上，氨氯地平降低细胞内钙浓度，抑制钙内流，下调H3K27ac和CaM-CAMKII-CREB1通路活性。Cav1.2激动剂能中和氨氯地平的抗增殖作用，证实其作用特异性。

2.7 临床使用钙通道阻滞剂与改善预后相关

临床队列分析显示，接受CCBs治疗的高血压患者相比未接受CCBs的高血压患者和无高血压患者，具有更好的PFS、更低的肝转移和淋巴转移率，以及更低的高分级比例。典型病例影像学资料证实，CCBs用药患者术后无复发表现。

3 讨论

本研究首次揭示了pNEN中Cav1.2介导的钙信号与H3K27ac表观调控之间的正反馈环路机制。Cav1.2在pNEN细胞中特异性表达，通过CaM-CAMKII-CREB1通路招募P300/CBP，促进局部H3K27ac修饰，进而增强CACNA1C表达，形成恶性循环推动肿瘤进展。

研究发现CCBs特别是氨氯地平能有效破坏这一正反馈环路，抑制pNEN进展。临床数据支持CCBs用药与改善预后的相关性，为pNEN治疗提供了新的靶向策略。相比现有治疗药物，CCBs具有安全性高、耐受性好的优势，具有重要的临床转化价值。

4 方法

研究采用临床样本分析、细胞实验、动物模型和多组学数据分析相结合的策略。实验方法包括Western blot、qRT-PCR、免疫组化、免疫荧光、ChIP、Co-IP、单分子成像等先进技术。统计分析使用GraphPad Prism和R软件，所有实验均进行至少3次独立重复。