《Advanced Science》：Targeted Extracellular Vesicles Deliver Asiaticoside to Inhibit AURKB/DRP1-Mediated Mitochondrial Fission and Attenuate Hypertrophic Scar Formation
编辑推荐：
本文推荐：本研究首次揭示巨噬细胞线粒体过度分裂是增生性瘢痕（HS）形成的关键机制，发现极光激酶B（AURKB）介导的DRP1 Ser616位点磷酸化是核心驱动因素。通过机器学习筛选鉴定天然小分子积雪草苷（AS）为新型AURKB抑制剂，并创新性构建cRGD修饰的细胞外囊泡（EVs）靶向递送系统（AS@cRGD-EVs），显著提升AS的生物利用度和靶向性。该研究为HS治疗提供了新的线粒体靶向干预方案。
1 引言
增生性瘢痕（HS）是创伤愈合异常导致的纤维增生性病变，其高发病率与治疗手段缺乏形成鲜明对比。本研究团队发现巨噬细胞线粒体动力学失衡是HS形成的关键环节。极光激酶B（AURKB）作为细胞周期核心调控因子，近期被发现参与非有丝分裂功能，包括氧化应激和炎症信号调控。通过转录组分析，研究团队首次揭示AURKB-DRP1（Ser616）轴在HS巨噬细胞线粒体过度分裂中的核心作用。
2 材料与方法
研究采用人和小鼠HS组织标本，通过透射电镜（TEM）观察线粒体超微结构，利用磁珠分选（MACS）技术分离原代瘢痕巨噬细胞。采用激光共聚焦显微镜（LSCM）进行线粒体形态学分析，通过蛋白质印迹和免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白相互作用。机器学习辅助虚拟筛选ZINC20数据库鉴定AURKB抑制剂，采用微尺度热泳动（MST）和分子对接验证结合亲和力。创新性构建cRGD肽修饰的细胞外囊泡（AS@cRGD-EVs）递送系统，并通过小鼠复发性瘢痕模型（RSM）评估治疗效果。
3 结果
3.1 HS巨噬细胞存在线粒体过度分裂和炎症反应
TEM显示人和小鼠HS组织中巨噬细胞线粒体呈现显著碎片化。与原代 Sham组巨噬细胞相比，RSM来源巨噬细胞线粒体长度从2-4μm的管状形态转变为0.2-1μm的颗粒状形态（p<0.001）。线粒体膜电位（MMP）检测显示JC-1单体比例显著增加（p<0.001），细胞因子芯片检测发现IL-1α、GM-CSF、TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子表达上调。
3.2 LPS诱导巨噬细胞DRP1 Ser616磷酸化水平升高
转录组分析鉴定出21个线粒体分裂相关差异基因，其中动力相关蛋白1（DRP1）的Gini评分最高。免疫荧光和蛋白质印迹显示LPS刺激后DRP1向线粒体转位增加（p<0.01），DRP1（Ser616）/总DRP1比值显著升高（p<0.01），而Ser637位点磷酸化无显著变化。
3.3 抑制线粒体分裂调控炎症反应
Mdivi-1处理可逆转LPS诱导的线粒体分裂，降低活性氧（ROS）产生（p<0.01），恢复MMP（p<0.01），并抑制线粒体DNA（mtDNA）向胞质外流（p<0.001）。细胞因子检测表明Mdivi-1显著抑制IL-1α、GM-CSF、TNF-α、IL-6和IL-1β表达。
3.4 AURKB调控DRP1磷酸化和线粒体分裂
基因集富集分析筛选出3个DRP1相关丝氨酸激酶基因（BMPR1A、HSP90AA1、AURKB），其中仅AURKB在RSM巨噬细胞中表达显著上调（p<0.01）。AURKB抑制剂Barasertib可逆转LPS诱导的DRP1（Ser616）磷酸化（p<0.01），Co-IP证实AURKB与DRP1存在直接相互作用。
3.5 AS被鉴定为AURKB潜在调节剂
机器学习筛选发现积雪草苷（AS）与AURKB结合亲和力（Ki）低于100nM。分子对接显示AS与AURKB结合能为-7.71±0.44 kcal mol-1，与ATP共享ASN-205结合位点。MST测定结合解离常数（Kd）为4.393μM，激酶活性实验证实AS可浓度依赖性抑制AURKB活性。
3.6 工程化AS@cRGD-EVs的制备与表征
cRGD修饰的EVs平均粒径为158nm，包封率（EE%）达88%，载药量（DL%）为16.9%。体外释放实验显示24小时累积释放率达45.91%。体外吞噬实验表明AS@cRGD-EVs组Cy2荧光强度显著高于AS@EVs组（p<0.001），体内靶向实验证实cRGD修饰显著提高巨噬细胞递送效率。溶血实验和生物相容性评估显示良好安全性。
3.7 AS@cRGD-EVs抑制AURKB-DRP1（Ser616）介导的线粒体分裂
AS@cRGD-EVs处理可逆转LPS诱导的线粒体过度分裂（p<0.01），降低DRP1线粒体转位率（p<0.001），显著抑制DRP1（Ser616）磷酸化（p<0.05）。ELISA检测显示AS@cRGD-EVs显著抑制GM-CSF、IL-6和TNF-α分泌（p<0.01）。
3.8 AS@cRGD-EVs对小鼠RSM模型的疗效
体内实验显示AS@cRGD-EVs组瘢痕表面积显著小于游离AS组（p<0.001），瘢痕抬高指数（SEI）和胶原体积分数显著降低（p<0.05）。TEM和免疫荧光证实AS@cRGD-EVs处理显著改善线粒体形态（p<0.001），Western blot显示DRP1（Ser616）磷酸化水平显著下调（p<0.001），炎症因子芯片检测证实促炎因子表达受到显著抑制。
4 讨论
本研究首次阐明AURKB-DRP1（Ser616）轴在HS巨噬细胞线粒体分裂中的核心作用，突破传统认知中CDK1或CaMKII等激酶对DRP1的调控模式。AS@cRGD-EVs通过精准靶向递送，实现局部高效抗炎和抗纤维化效应。虽然cRGD介导的靶向性具有显著优势，但EVs的全身分布特性和长期安全性仍需进一步评估。该研究为HS治疗提供了新的线粒体靶向策略，也为其他纤维化疾病治疗提供了新思路。
5 结论
AURKB-DRP1（Ser616）轴驱动的巨噬细胞线粒体过度分裂是HS形成的关键机制。AS@cRGD-EVs通过精准靶向调控该通路，有效恢复线粒体动力学平衡，抑制炎症反应，显著减轻瘢痕形成。这一研究成果不仅建立了HS发病的线粒体新范式，更为临床转化提供了具有应用前景的纳米治疗策略。
