靶向线粒体ECSIT过表达通过上调OTUD3稳定SIRT3减轻MASH的新机制

《Advanced Science》：Targeted Mitochondrial ECSIT Overexpression Attenuates MASH by Increasing OTUD3 Expression

本研究揭示了线粒体蛋白ECSIT在代谢相关脂肪性肝炎（MASH）中的关键保护作用。研究发现，在MASH模型中，线粒体ECSIT表达下调，而其靶向过表达可通过招募去泛素化酶OTUD3至线粒体，特异性去除SIRT3的K48连接泛素化修饰，从而稳定SIRT3蛋白。这一ECSIT/OTUD3/SIRT3信号轴能有效减轻线粒体DNA（mtDNA）氧化损伤、抑制线粒体活性氧（mROS）产生并改善线粒体功能，最终显著缓解饮食诱导的小鼠MASH表型（包括肝脏脂肪变性、炎症和纤维化）。该研究为MASH的发病机制提供了新见解，并提示线粒体ECSIT是潜在的治疗靶点。

　　

1 引言

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球范围内影响约十亿人的常见慢性肝病，其高级阶段代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）以持续性肝脏炎症和纤维化为特征，显著增加肝硬化和肝细胞癌（HCC）风险。线粒体功能障碍在MASH发病中扮演关键角色，特别是线粒体DNA（mtDNA）因其无组蛋白结构且靠近活性氧（ROS）生成位点，易在代谢应激下受损，进而激活模式识别受体（PRRs）触发先天免疫反应，维持肝脏促炎环境。SIRT3（Sirtuin 3）作为主要的线粒体去乙酰化酶，调控超过60%的线粒体蛋白乙酰化水平，对维持线粒体功能至关重要。然而，在MASLD/MASH进展中，肝脏SIRT3表达下调的机制尚不明确。蛋白质泛素化与去泛素化平衡对维持线粒体完整性至关重要。卵巢肿瘤结构域蛋白3（OTUD3）是一种广泛分布于哺乳动物组织中的去泛素化酶，新近证据提示其可能定位于线粒体。进化上保守的信号中间体（ECSIT）是一种多功能衔接蛋白，在调控线粒体能量代谢中发挥重要作用，但其在MASH相关线粒体质量控制和肝细胞脂毒性中的作用尚未被探索。

2 结果

2.1 MASH模型中线粒体ECSIT蛋白表达降低

在高脂高胆固醇（HFHC）饮食诱导的MASH小鼠模型中，肝脏线粒体ECSIT蛋白水平在早期（4、8周）无显著变化，但在12周和16周时显著降低。在蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食模型中，ECSIT下调出现更早，3周时呈下降趋势，8周时显著降低。免疫荧光染色证实，两种饮食模型小鼠肝组织中定位于线粒体的ECSIT信号均减弱。该下调现象特异性地发生在肝细胞中，而非非实质细胞。体外实验中，用棕榈酸和油酸（PO）处理原代肝细胞模拟脂毒性应激，24小时后线粒体ECSIT蛋白水平显著下调，且此效应具有浓度和时间依赖性。

2.2 靶向线粒体ECSIT过表达减缓HFHC诱导的MASH进展

构建了线粒体靶向ECSIT转基因（ECSIT^MTG）小鼠。与野生型（WT）小鼠相比，HFHC饮食喂养16周后，ECSIT^MTG小鼠肝脏重量和肝体比显著降低，空腹血糖水平下降，葡萄糖耐量（GTT）和胰岛素耐量（ITT）改善。肝脏甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）含量降低，H&E和油红O染色显示肝脏脂肪变性显著减轻，NAFLD活动度评分（NAS）降低。此外，ECSIT^MTG小鼠肝脏中F4/80阳性炎症细胞浸润减少，促炎细胞因子（Tnf、Il-6、Il-1b、Cxcl2）mRNA表达下调，胶原沉积（Masson和天狼星红染色）及纤维化相关基因（Col3a1、Ctgf、Tgfb1）表达减少，血清ALT和AST水平也显著降低。

2.3 靶向线粒体ECSIT过表达阻遏MCD诱导的MASH进展

在MCD饮食诱导的MASH模型中，ECSIT^MTG小鼠同样表现出减轻的肝脏病理表型。与WT小鼠相比，其肝脏重量增加和肝体比升高受到抑制，肝脏TG和TC含量显著降低，肝脂肪变性、炎症细胞浸润和胶原沉积均得到明显改善，血清ALT和AST水平更低。

2.4 线粒体ECSIT过表达减轻mtDNA氧化损伤并恢复线粒体完整性

PO刺激导致原代肝细胞mtDNA氧化损伤（8-OHdG染色增强）、mROS产生增加、线粒体膜电位（ΔΨm，JC-1染色评估）丧失、线粒体超微结构出现肿胀和嵴断裂、线粒体网络解体。而过表达线粒体ECSIT能有效逆转这些异常，减轻ox-mtDNA水平，抑制mROS过度产生，稳定ΔΨm，并改善线粒体形态和网络结构。

2.5 ECSIT以泛素化依赖性方式抑制SIRT3降解

通过临床MASH蛋白质组学数据库（PDX046940）分析，筛选出SIRT3作为潜在的下游效应分子。HFHC或MCD饮食均降低小鼠肝脏SIRT3蛋白水平，而ECSIT过表达可部分逆转此下降。蛋白酶体抑制剂MG132能缓解PO引起的SIRT3降低，蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）追踪实验表明PO加速SIRT3蛋白降解，ECSIT过表达则延缓此过程。免疫共沉淀证实，ECSIT过表达能抑制PO诱导的SIRT3泛素化，特别是K48连接的泛素化。

2.6 ECSIT招募OTUD3至线粒体并通过K48去泛素化稳定SIRT3

HFHC饮食降低了肝脏总OTUD3及线粒体OTUD3蛋白水平，ECSIT过表达可缓解此下降。体外实验显示，线粒体靶向ECSIT过表达增加了PO刺激下肝细胞线粒体内的OTUD3。分子对接和免疫共沉淀实验证实ECSIT与OTUD3存在物理相互作用，且在HFHC条件下，ECSIT过表达增强了二者的结合。敲低OTUD3可取消ECSIT对SIRT3蛋白水平的提升作用及其对SIRT3泛素化的抑制。分子对接和截断体实验表明，OTUD3通过其OTU结构域与SIRT3相互作用，其UBA结构域也对SIRT3的完全去泛素化活性是必需的。OTUD3可直接去泛素化SIRT3。

2.7 ECSIT-OTUD3-SIRT3信号轴调控PO诱导的MASH进展

在肝细胞中，ECSIT过表达对PO诱导的mtDNA氧化、mROS产生、ΔΨm丧失、线粒体呼吸功能（氧消耗速率OCR）受损、脂质积累和炎症基因表达的改善作用，在敲低OTUD3后被取消，而过表达SIRT3则可部分挽救OTUD3敲低带来的负面效应。这表明ECSIT通过OTUD3稳定SIRT3，从而发挥其保护作用。

3 讨论

本研究首次揭示了线粒体ECSIT在MASH发病机制中的关键作用。ECSIT表达下调是MASH阶段的一个特征性事件。恢复线粒体ECSIT表达可通过上调线粒体OTUD3，进而稳定SIRT3蛋白（通过去泛素化），最终减轻mtDNA氧化损伤、改善线粒体功能，从而缓解肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。这一新发现的ECSIT/OTUD3/SIRT3信号轴为理解MASH的分子机制提供了新视角，并提示靶向该通路可能成为MASH的潜在治疗策略。研究也存在局限性，例如缺乏体内直接验证SIRT3在此轴中必要性的救援实验，且全身性转基因模型未能排除其他组织的贡献。ECSIT在细胞质中作为TLR信号适配体的潜在作用也需进一步探讨。

4 结论

线粒体ECSIT通过促进OTUD3的线粒体定位以维持SIRT3稳定性，从而清除氧化mtDNA、阻止MASH进展。这一机制为MASH病理提供了新见解，并具有治疗潜力。

5 实验部分

（此部分为方法学描述，主要包括动物模型构建、细胞培养与处理、分子生物学实验方法、统计学分析等具体技术细节，根据要求在此不再详细展开复述）。